Vi beskriver en ny eksperimenterende teknik, som vi kalder minimalt Invasive muskel Embedding (MIME), som er baseret på beviser, skeletmuskulatur væv indeholder levedygtige myogenic celler, der kan lette donor-celle-medieret myogenesis når implanteret i en vært muskel.
Skeletmuskulatur besidder regenerative kapacitet på grund af væv-resident, muskel-fiber-generering (myogenic) satellit celler (SCs), som kan danne nye muskelfibre under de rette betingelser. Selv om SCs kan høstes fra muskelvæv og kulturperler i vitro, er de resulterende myoblast celler ikke meget effektive til at fremme myogenesis når transplanteret ind i værten muskel. Kirurgisk udsætter vært muskel og podning segmenter af donor muskelvæv eller de isolerede muskelfibre med deres SCs på vært muskel, fremmer bedre myogenesis i forhold til myoblast transplantation. Vi har udviklet en ny teknik, som vi kalder minimalt Invasive muskel Embedding (MIME). MIME indebærer passerer en kirurgisk nål gennem host muskel, tegning et stykke af donor muskelvæv gennem nålen spor og derefter forlader donorvæv indlejret i vært muskel, således at det kan fungere som en kilde til SCs for værten muskel. Her beskriver vi i detaljer trin involveret i at udføre MIME i en immundefekte musemodel, der udtrykker en grøn fluorescerende proteiner (NGL) i alle dens celler. Immundefekt i host-mus reducerer risikoen for immun afvisning af donorvæv, og normal god landbrugspraksis udtryk giver mulighed for nem identifikation af vært muskelfibre (normal god landbrugspraksis +) og donor-celle-afledte muskelfibre (normal god landbrugspraksis-). Vores pilot data tyder på at MIME kan bruges til implantatet en extensor digitorum longus (EDL) muskel fra en donor mus i tibialis anterior (TA) muskel vært musen. Vores data tyder også på, når en myotoxin (bariumchlorid, BaCl2) indsprøjtes i vært muskel efter MIME, der er bevis for, at donor-celle-afledte myogenesis i host muskel, med ca. 5%, 26%, 26% og 43% af fibrene i en enkelt vært TA muskel viser ingen vært bidrag, minimal vært bidrag, moderat vært bidrag og maksimal vært bidrag, henholdsvis.
Sund skeletmuskulatur, selvom post mitotiske, besidder fremragende regenerative kapacitet på grund af tilstedeværelsen af væv-resident myogenic celler kendt som satellit celler (SCs)1,2; og gennemgik i3,4. Dog under patologiske tilstande forårsaget af muskuløse dystrophies, traume eller accelereret ældning, muskler regeneration kan ikke holde op med muskel opdeling, og dermed, progressive muskel fiber tab opstår5. Selv om effektive metoder er blevet udviklet for at isolere SCs fra muskel og udvide dem i kultur til at generere store mængder af myoblasts (og senere myotubes), har forsøg på at generere fysiologisk relevante tal af muskelfibre i vært muskel gav kun minimal succes6. Som med mange andre celletyper, når myoblasts er alene injiceres værten væv, de fleste af cellerne ikke indpode7,8. Vi har vist, at neuromuskulære elektrisk stimulation (NMES) letter donor-celle-afledte myogenesis i regenerering-mangelfuld vært mus muskel, der blev sprøjtet med menneskelige myoblasts8. Andre har vist, at kirurgisk podning biopsi muskel eller enkelt muskelfibre med vedlagte SCs, lette moderat myogenesis selv uden NMES, tyder på, at implantere hele muskelfibre med SCs kunne være mere fordelagtig end implanterer myogenic celler alene9,10. Da donor eller manipuleret muskelvæv podet ind vært muskel producerer bedre resultater end omplantning celler alene, er det muligt at væv eller væv-lignende strukturer kan give afgørende stikord til donor-celle engraftment; et koncept, som bliver stadig mere tydeligt i celle-terapi undersøgelser, hvor forskellige celle typer10,11,12.
De seneste data tyder på, at SCs fremstillet af mennesker mere end 2 uger efter slagtning generere myotubes i kultur13. Vi agter derfor at vurdere hvis implantering af muskel væv høstet slagtning i en levende vært vil vende muskel fiber tab. Vi har udviklet en ny teknik kaldet MIME for at implantere donor muskelvæv i skeletmuskulatur væv af en levende vært for at fremme donor-celle-afledte myogenesis. MIME indebærer passerer en kirurgisk nål gennem host musklen til at skabe en nål spor; tegning et lille segment af donor muskelvæv gennem nålen spor; forlader donorvæv indlejret i vært musklen; og lukke nålen hullerne med væv klæbemiddel. Efter at øve teknik i aflivede mus studerede i andre eksperimenter, vi har nu udført MIME i levende mus, der er immundefekte og allestedsnærværende udtrykker en grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis), og opfølgning på 3 og 14 dage efter MIME. På 3 dage efter MIME bekræfter vi, at donor mus (normal god landbrugspraksis-) EDL muskel implanteret i vært mus (normal god landbrugspraksis +) TA muskel, forbliver integreret i vært muskel. På 14 dage efter MIME, bekræfte efter back2 myotoxin skade at fremkalde skader og myogenesis, vi, at cirka 5%, 26%, 26% og 43% af fibrene i en enkelt vært TA muskel viser ingen vært bidrag, minimal vært bidrag, moderat vært bidrag og maksimal vært bidrag, henholdsvis. Centrale Nukleering (en markør af degeneration og efterfølgende regenerering) ses hos ca 95% af TA muskelfibre efter MIME og myotoxin injektion.
Vi studere TA muskler 14 dage efter MIME + BaCl2 fordi dette tidspunkt indfanger den mellemliggende fase af regenerering, når et flertal af regenererede fibre er centralt nukleeret. Vi studere normal god landbrugspraksis + mus som værter for MIME, så at når vi i sidste ende transplantation menneskelige dødt muskel til vært mus, vil vi kunne let skelne muskelfibre af værten og donor oprindelse. Vi bruger musen EDL muskel som den eksperimentelle donorvæv, da enkelt fibre fra denne muskel har vist større myogenic potentiale end TA muskler9. EDL muskel er også synergistisk til TA muskel og har lignende fiber-type sammensætning. Vores foreløbige data tyder på at MIME er i stand til at lette donor-celle-afledte myogenesis i host muskel.
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for den nye eksperimentelle teknik kendt som MIME, udviklet i vores laboratorium, til implantatet donor muskelvæv i vært muskelvæv. Dette er en tilpasning af en åben muskel podning teknik, der allerede har vist sig for at være effektive til at fremme donor-celle-medieret myogenesis i en vært muskel9,10,17.
Målet med MIME er ikke at aktivere engraftment af donor muskelvæv selv i vært musklen (vi ikke ved i øjeblikket, hvis dette sker), men snarere at give en kilde til donor SCs, der kan bidrage til myogenesis i host musklen under betingelser, der stimulerer m muskelstyrke regenerering. Vores håb er, at efter MIME er blevet optimeret og testet i grundlæggende og prækliniske undersøgelser, kunne det give værdifuld indsigt til at vejlede kliniske behandlinger til formål at øge muskel regenerering i skeletmuskulatur, der har undergået myogenic muskeltab.
Der er mange spørgsmål, der endnu mangler at blive besvaret med hensyn til hvordan MIME kunne oversættes til en klinisk behandling, for eksempel: Hvordan vil vi kontrollere kvaliteten af donorvæv? Hvordan vil vi styre immun afvisning af donorvæv og celler? Af donorvæv fjernes efter at levere celler til myogenesis eller det efterlader et fibrotisk ar? Påvirker donor og/eller vært muskel fiber type donor-celle-medieret myogenesis? Hvilke muskler kan praktisk gavn MIME? Vi udvider i øjeblikket vores undersøgelser at vurdere hvis MIME er sikker og effektiv, identificere tillægsbehandling behandlinger, der kan forøge donor-stammer myogenesis, og besvare mange af de spørgsmål, der er anført ovenfor.
Efter at have afsluttet vores test af mus til mus allogen transplantation med MIME, er vores næste skridt at udføre menneskelige til musen MIME med dødt menneskelige væv for at evaluere de myogenic potentiale af dødt muskelvæv. Vi forventer, at disse forsøg vil føre til en ny linje af grundlæggende og Translationel forskning, der indebærer muskelvæv fra donorer, der er registreret i initiativer som kroppen testamentarisk gave Program for uddannelse og livets gave program for organdonation .
De repræsentative data præsenteret i dette manuskript foreslår, at 14 dage efter MIME, er flere levedygtige myofibers, der enten mangler normal god landbrugspraksis eller har lave niveauer af normal god landbrugspraksis. Vores fortolkning af disse data er, at normal god landbrugspraksis-donor satellit celler bidrog til myogenesis i host muskel. Vi udførte dette eksperiment i forberedelse til implantering af menneskelige dødt væv i en vært mus muskel. For at demonstrere utvetydigt at donor satellit celler bidrager til myogenesis i host musklen efter MIME, ville det være nyttigt at implantere donorvæv, der udtrykker en fluorescerende reporter, som kan skelnes let fra normal god landbrugspraksis (f.eks., rødt fluorescerende proteiner udtrykker donorvæv implanteret i normal god landbrugspraksis + vært muskel).
Denne teknik er hovedsageligt begrænset arten af SCs i donorvæv. Hvis SCs i donorvæv er levedygtige, teknikken er tilbøjelige til at lette donor-celle-medieret myogenesis, mens hvis de ikke er levedygtige, myogenesis kan ikke forekomme. Men da SCs er meget modstandsdygtige og er rentabelt for ca 2 uger post mortem, det er meget sandsynligt, at til forsøgsformål, de donorvæv, der er implanteret i et par minutter efter høst vil lette donor-celle-medieret myogenesis13 . Desuden som hentydede til ovenfor, er det muligt, at siden den hele muskelvæv, (der indeholder SCs samt modne muskelfibre og muskel-resident fibroblaster) er indlejret i vært musklen, fibrose kan forekomme. Denne antagelse skal dog undersøges empirisk. Litteratur på muskelskader som følge af skadevoldende sammentrækninger, cryoinjury og eksperimenterende myotoxins, tyder på, at immun celler (hovedsagelig makrofager) er i stand til at effektivt clearing cellular vragdele fra beskadigede fibre og remodeling det ekstracellulær matrix18. Det er derfor muligt, at efter MIME og BaCl2 indsprøjtning, så længe værten immunceller har adgang til udarter donor muskelfibre, kunne de klare aflejringskegler, efterlod blot donor SCs. Endelig, omfanget af donor-stammer myogenesis er afhængig af mængden af donor muskelvæv, der er integreret i vært musklen. For at vært muskel rum til at være helt genbefolket af donor-celle-afledte myofibers, ville det kræve en metode som X – eller gamma-bestråling til ablate vært muskel SCs og også kræve gentagne MIME-procedurer.
Det er blevet påvist, at kirurgisk udsætter en vært musklen og suturering et stykke af donorvæv på vært muskel kan lette donor-celle-medieret myogenesis9,10,17. Denne åbne kirurgisk tilgang har været anvendt i tidligere til at spore udviklingen af myogenesis og til at generere musemodeller for menneskelig muskel sygdomme. Det innovative aspekt af MIME-teknik er, at det er minimalt invasiv og ikke indebærer kirurgisk udsætter vært muskel. Dette reducerer risikoen for iatrogen infektion og graden af ubehag i vært dyr, derfor at gøre det mere realistisk at udføre MIME gentagne gange på den samme vært muskel hvis nødvendigt.
Vi forventer, at MIME-teknik kan være et egnet raffinement åben kirurgisk tilgang, der er i øjeblikket følges for at implantat donor muskelvæv i en vært mus. Dette kunne fremskynde generation af humaniseret musemodeller, ved at integrere biopsi menneskelige muskel i vært mus muskel. Derudover forventer baseret på vores foreløbige data fra mus til mus podning, vi, at MIME vil være effektiv i at opnå donor-celle-medieret myogenesis fra menneskelige dødt donorvæv som donor SCs er levedygtige. Endelig, med yderligere test og validering, vi håber at MIME teknik vil hjælpe med at udvikle nye behandlingsformer for at lette donor-celle-medieret myogenesis hos mennesker med muskel sygdomme.
Succes af MIME-teknik er kritisk afhængige af netop indlejring donorvæv inden for den fascial rum (epimysium) host musklen. Kun hvis donorvæv placeres inden for værten muskel rum, vil det kunne give vært muskel SCs i en præcis måde. Hvis donorvæv er placeret uden for værten muskel, er det uklart, hvad der ville være sin skæbne. I vores eksperimentel model for MIME bruger vi TA muskel som vært muskel, da det er fremtrædende og overfladisk placeret i det anterolaterale aspekt af benet. Størrelse, retning og anatomisk stilling TA musklen, gør det nemt at bekræfte at donorvæv er placeret korrekt i vært TA muskel efter MIME. I dette papir, vi har givet eksperimentelle bevismateriale, donorvæv relysnettet indlejret i vært TA muskel på 3 dage efter MIME, og at der er donor-celle-medieret myogenesis i host muskel på 14 dage efter MIME.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev muliggjort af en Pilot-ydelse fra Alliancen til regenerativ rehabilitering forskning og uddannelse (AR3T) og et fakultet start pakke fra Wayne State University til KRUKKE. AR3T understøttes af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og menneskelige udvikling (NICHD), National Institute for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde (NINDS), og nationale Institut for biomedicinsk Imaging og bioteknologi (NIBIB ) af de nationale kontorer i sundhed under Award nummer P2CHD086843. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |