血管視覚化のためのDiI灌流<em> Ambystoma mexicanum</em
Summary
Ambystoma mexicanumは親油性の1,1'-Dioctadecy-3,3,3 '、3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（DiI）染色法を用いて、脈管構造の容易な可視化を可能にする血管灌流を受けることができる。
Abstract
灌流技術は、組織の循環を可視化するために何世紀にも使用されてきた。 Axolotl（Ambystoma mexicanum）は、再生研究の必須モデルとして浮上してきたサンショウウオの種です。これらの動物における再生の状況において血管再生がどのように起こるかについてはほとんど知られていない。ここでは、1,1'-Dioctadecy-3,3,3 '、3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（DiI）の灌流による軸索における脈管構造の可視化のための簡単な方法を報告する。 DiIは、内皮細胞の原形質膜に瞬間的に挿入する親油性カルボシアニン色素である。 DiIが大動脈を通って循環に入るように、蠕動ポンプを用いて灌流を行う。灌流の間に、色素は軸索の血管を流れ、接触すると血管内皮細胞の脂質二重層に取り込まれる。灌流の手順は、8インチの軸索の場合約1時間かかる。灌流直後Axiotlは、共焦点蛍光顕微鏡で視覚化することができる。 DiIは、緑色の蛍光フィルターで励起されると、赤 – オレンジ色の範囲で発光します。このDiI灌流手順は、軸索の血管構造を視覚化するために、または再生組織における血管再生のパターンを示すために使用することができる。
Introduction
脈管構造の可視化は、多くの種の生物の構造と機能を理解する上で不可欠な役割を果たします。レオナルド・ダ・ヴィンチとの16世紀の時代から、循環のモデルとグラフィック表現が研究されました1 。ワックスとゴムの型を使用して、組織を灌流して脈管構造の3次元モデルを作成し、器官形成と病因の研究1,2を可能にした 。樹脂やワックスはインドインキやカルミンレッドなどの染料で着色されており、視覚化が容易になりました1,2 。しかしながら、これらの技術は、それらの高い粘度が関心組織1の完全な灌流を妨げたので、多くの問題を引き起こした。フィールドがより洗練されたように、共焦点顕微鏡と電子顕微鏡の使用が開始され、灌流techniq鋳型から離して脈管構造の液体灌流に向かい、その一部は最初の組織を破壊することなく血管の灌流および造影を可能にした3 。蛍光カルボシアニン色素であるDiIは、血管組織を損傷することなく動物の灌流を可能にするそのような染色の1つである。
カルボシアニン色素は、接触すると細胞膜に取り込まれる親油性色素である。これらの色素は、血管内皮細胞の容易かつ瞬時の染色を可能にし、蛍光共焦点顕微鏡の下で見ることができる。 DiIは、細胞の脂質膜の側方拡散を介して動く。これは、ニューロンのラベリングおよびトレース4に示される。化学的には、DiIの2つのアルキル鎖は色素に細胞膜に対する高い親和性を与え、一方、緑色蛍光光フィルターによって励起されたときに赤色波長を放射する原因となる蛍光色素からの2つの共役リング> 4。 DiIは、形質膜の標識の成功、およびニューロンにおける順行性および逆行性両方の標識化を含む、多くの能力において利用されている5,6。 DiIは、マウスの脈管構造を視覚化しながら、以前は灌流プロトコールで使用されていました7 。
Axolotls（ Ambystoma mexicanum ）はメキシコのメキシコシティ近くの汽水湖に独占的に生息するサラマンダーです。これらの動物は、完全な四肢、尾（神経脊髄を含む）、心臓の一部および他の内臓、および大人の眼の部分を再生することができるため、再生プロセスを理解するための重要なモデルとなっている。さらに、Axolotlsにおける遺伝子ツールの最近の応用により、これらのプロセスを駆動する分子および細胞に対する前例のない洞察が可能になりました8 。成功したレグネ四肢全体の割合は、酸素および栄養素を提供する際の血管の伝統的な機能だけでなく、再生において重要な役割を果たす可能性がある広範な血管再生プロセスを必要とする。組織再生の文脈における血管再生の理解は不可欠である。 Axolotlの血管は、以前はインドのインクを使用して視覚化されていましたが、その結果は興味深いものでしたが、このプロセスは10年後に再訪されていません10 。本発明者らは、哺乳動物に使用するために開発されたDiI灌流プロトコールを適応させて、軸索脈管構造の完全な灌流および視覚化を可能にすることを試みた7 。このプロトコールは、DiI染色技術を用いて軸索循環を首尾よく灌流し、続いて視覚化するためのステップを説明する。この手順は、恒常性組織における再生血管および再生血管における正確な視覚化を可能にし、視覚化のための新しい方法を提供するaxolotlにおける血管再生プロセスの分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
Axolotlの脈管構造の可視化は、親油性カルボシアニン色素DiIによる灌流によって首尾よく達成することができる。本研究では、蠕動ポンプを用いてDiIで軸索を灌流するための新規プロトコールを記載する。我々はまた、蛍光共焦点顕微鏡を用いて軸索脈管構造のその後の可視化を示す。このプロトコルは、Li らに見られるげっ歯類DiI灌流プロトコールの適応であった。しかし、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Brigham＆Women's HospitalとMarch of Dimesの支援を受けました。著者はWhited Labのメンバー全員の支援と助言に感謝したいと思います。
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
Riferimenti
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