혈관 시각화를위한 DiI 관류<em> 암 브리 스 토마 멕 시카 눔</em
Summary
친 유성 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) 염색 기술을 사용하여 Ambystoma mexicanum 은 혈관 관류를 쉽게 시각화 할 수 있도록 혈관 재관류를받을 수 있습니다.
Abstract
관류 기술은 조직 순환을 시각화하기 위해 수세기 동안 사용되어 왔습니다. Axolotl (Ambystoma mexicanum)은 재생 연구에 필수적인 모델로 부상 한 도롱뇽 종입니다. 이러한 동물에서 재생의 맥락에서 혈관 재개 골이 어떻게 발생하는지에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 여기에 우리는 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)의 관류를 통한 axolotl에서 vasculature의 시각화를위한 간단한 방법을보고합니다. DiI는 내피 세포의 원형질막에 순간적으로 삽입되는 친 유성 카보시 아닌 염료이다. 관류는 DiI가 대동맥을 통해 혈액 순환을 시작하도록 연동 펌프를 사용하여 이루어집니다. 관류 중에 염료는 axolotl의 혈관을 통해 흐르고 접촉시 혈관 내피 세포의 지질 이중층으로 통합됩니다. 관류 절차는 8 인치 axolotl에 대해 약 1 시간이 걸립니다. 관류 직후Axiotl은 공 촛점 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. DiI는 녹색 형광 필터로 여기 될 때 적색 주황색 범위에서 빛을 방출합니다. 이 DiI 관류 절차는 axolotls의 혈관 구조를 시각화하거나 재생 조직에서 revascularization의 패턴을 보여주는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
vasculature의 시각화는 많은 종의 생물체의 구조와 기능을 이해하는 데 중요한 역할을합니다. 레오나르도 다빈치 (Leonardo da Vinci)와 함께 16 세기를 시작으로 순환의 모델과 그래픽 표현이 연구되었습니다 1 . 왁스와 고무 몰드를 사용하여 조직을 관류하여 혈관 구조의 3 차원 모델을 만들어 기관 발생과 병인에 대한 연구를 허용했다. 수지 및 왁스는 인도 잉크 또는 카민 레드와 같은 염료로 착색되어 쉽게 시각화 할 수있었습니다 1 , 2 . 그러나,이 기술은 높은 점도가 관심있는 조직의 완전한 재관류를 방해했기 때문에 많은 문제를 야기했습니다. 분야가 더욱 정교 해짐에 따라 공 초점 및 전자 현미경을 사용하여 관류 기술을 이동 시켰습니다 주형에서 떨어져서 혈관계의 액체 관류로 이동하며, 그 중 일부는 초기 조직을 파괴하지 않고 혈관의 관류 및 영상화를 허용한다. 형광 색소 인 DiI는 혈관 조직에 손상을주지 않고 동물의 재관류를 허용하는 얼룩 중 하나입니다.
Carbocyanine 염료는 접촉시 세포막에 통합되는 친 유성 염료입니다. 이 염료는 혈관 내피 세포를 쉽고 즉각적으로 염색 할 수있게하여 형광 공 촛점 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. DiI는 세포의 지질막에서 측면 확산을 통해 이동하며, 뉴런의 표지 및 추적에 나와 있습니다 4 . 화학적으로 DiI의 두 알킬 사슬은 염료에 세포막에 대한 높은 친 화성을 부여하는 반면 녹색 형광등 필터로 여기 될 때 적색 파장을 방출하는 형광 염료의 두 개의 공액 고리> 4. DiI는 뉴런 5 , 6 에서 원형질막의 성공적인 표지 및 전장 및 역행 라벨링을 포함한 많은 역량에 활용되어 왔습니다. DiI는 이전에 관류 프로토콜에서 마우스 7 의 혈관을 시각화하는 동안 사용되었습니다.
Axolotls ( Ambystoma mexicanum )는 멕시코 시티 인근의 소금기가 많은 호수에서 독점적으로 사는 도롱뇽입니다. 이 동물들은 전체 사지, 꼬리 (신경 코드 포함), 심장 및 기타 내장 기관의 일부 및 성인의 눈 부분을 재생할 수 있으므로 재생 과정을 이해하는 데 중요한 모델이되었습니다. 또한 Axolotls에 유전 도구를 최근에 적용함으로써 분자와 세포에 대한 전례없는 통찰력이 이제 가능 해졌다. 성공적인 재생산전체 사지 배합에는 광범위한 혈관 재개 화 과정이 필요하며 이는 단순히 산소와 영양소를 제공하는 혈관의 전통적인 기능 이상으로 중생에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 조직 재생의 맥락에서 재 시술을 이해하는 것이 필수적입니다. Axolotl 혈관은 이전에 India Ink를 사용하여 시각화되었으며 그 결과가 흥미 롭지 만이 과정은 이후 10 년 동안 재검토되지 않았습니다. 우리는 axolotl vasculature 7 의 완벽한 재관류 및 시각화를 허용하기 위해 포유류에서 사용하기 위해 개발 된 DiI 관류 프로토콜을 채택하려고했습니다. 이 프로토콜은 DiI 얼룩 기법으로 axolotl 순환을 성공적으로 관류하고 시각화하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 조직을 재생하는 것뿐만 아니라 항상성 조직에서 특허 혈관을 정확하게 시각화 할 수있게하며, 시각화를위한 새로운 방법을 제공합니다n 및 axolotl에서 revascularization 과정의 분석.
Protocol
Representative Results
Discussion
axolotl의 vasculature의 시각화는 lipophilic 카보시 아닌 염료, DiI와 재관류를 통해 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 이 연구에서는 연축 펌프를 사용하여 DiI로 axolotl을 재관류하기위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 형광 공 촛점 현미경을 사용 axolotl vasculature의 후속 시각화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 Li et al. 에서 볼 수있는 설치류 DiI 재관류 프로토콜의 적응 이다. <sup c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Brigham & Women 's Hospital과 March of Dimes에서 지원되었습니다. 저자는 Whited Lab의 모든 구성원의 지원과 조언에 감사드립니다.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
Riferimenti
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