DiI Perfusion som en metod för vaskulär visualisering i<em> Ambystoma mexicanum</em
Summary
Med användning av en lipofil 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat (DiI) -färgningsteknik kan Ambystoma-mexicanum genomgå vaskulär perfusion för att möjliggöra enkel visualisering av vaskulaturen.
Abstract
Perfusionstekniker har använts i århundraden för att visualisera cirkulationen av vävnader. Axolotl (Ambystoma mexicanum) är en art av salamander som har uppstått som en viktig modell för regenereringsstudier. Lite är känt om hur revaskularisering sker i samband med regenerering hos dessa djur. Här redovisar vi en enkel metod för visualisering av kärl i axolotl via perfusion av 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat (DiI). DiI är ett lipofilt karbocyaninfärg som omedelbart sätter in i plasmamembranet av endotelceller. Perfusion görs med hjälp av en peristaltisk pump så att DiI går in i cirkulationen genom aortan. Under perfusion strömmar färgämne genom axolotls blodkärl och inkorporeras i lipid-dubbelskiktet i vaskulära endotelceller vid kontakt. Perfusionsproceduren tar ungefär en timme för en åtta tum axolotl. Omedelbart efter perfusion wiTh DiI kan axolotl visualiseras med ett konfokal fluorescerande mikroskop. DiI sänder ljus i röd-orange sortimentet när det är upphetsat med ett grönt fluorescerande filter. Detta DiI-perfusionsförfarande kan användas för att visualisera den axulära kärlstrukturen eller för att visa mönster för revaskularisering i regenererande vävnader.
Introduction
Visualisering av kärl spelar en viktig roll för att förstå organismernas struktur och funktion i många arter. Från och med 1600- talet med Leonardo da Vinci har modeller och grafiska representationer av cirkulationen studerats 1 . Med hjälp av vaxer och gummiproppar perfusionerades vävnader för att skapa tredimensionella kärlmodeller, vilket möjliggjorde studier av organogenes och patogenes 1 , 2 . Hartser och vaxer färgades med färgämnen som Indien Ink eller carmine Red för att möjliggöra deras enkla visualisering 1 , 2 . Dessa tekniker orsakade emellertid många problem eftersom deras höga viskositeter förhindrade fullständig perfusion av vävnaden av intresse 1 . När fältet blev mer sofistikerat kom användningen av konfokala och elektronmikroskop till spel och flyttade perfusionsteknik Ues bort från gjutformar och mot vätskeformiga perfusioner av vasculaturen, av vilka några tillåts för perfusion och avbildning av blodkärl utan att förstöra den ursprungliga vävnaden 3 . DiI, ett fluorescerande karbocyaninfärgämne, är en sådan fläck som tillåter perfusion av djur utan skada på vaskulär vävnad.
Carbocyaninfärger är lipofila färgämnen som införlivar i cellmembran vid kontakt. Dessa färgämnen möjliggör enkel och ögonblicklig färgning av vaskulära endotelceller, som sedan kan ses under ett fluorescerande konfokalmikroskop. DiI rör sig via sidodiffusion i lipidmembranet av celler, såsom visas i märkningen och spårningen av neuroner 4 . Kemiskt ger de två alkylkedjorna av DiI färgämnet sin höga affinitet för cellmembran, medan två konjugerade ringar från en fluorokrom som är ansvarig för att avge en röd våglängd när den exciteras av grön fluorescerande ljusfilter> 4. DiI har använts i många kapaciteter, inklusive framgångsrik märkning av plasmamembranet och både anterograd och retrograd märkning i neuroner 5 , 6 . DiI har tidigare använts i perfusionsprotokoll medan man visualiserar vasculaturen hos möss 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) är salamandrar som lever exklusivt i bracka sjöar nära Mexico City, Mexiko. Dessa djur har blivit en viktig modell för att förstå regenerativa processer eftersom de kan regenerera hela lemmar, svans (inklusive näsnor), delar av hjärtat och andra inre organ och delar av ögat som vuxna 8 , 9 . Dessutom, med den senaste tillämpningen av genetiska verktyg i axolotl, är nu okomplicerad inblick i molekylerna och cellerna som driver dessa processer nu möjlig 8 . Den lyckade regenenRation av en hel extremitet kräver en omfattande revaskulariseringsprocess som kan spela en viktig roll vid regenerering utöver helt enkelt de blodkärlens traditionella funktioner för att tillhandahålla syre och näringsämnen. Förstå revaskularisering i samband med vävnadsregenerering är absolut nödvändigt. Axolotl blodkärl har tidigare visualiserats med hjälp av Indien Ink, och medan resultaten var spännande har denna process inte blivit omarbetad under de följande decennierna 10 . Vi försökte anpassa ett DiI-perfusionsprotokoll utvecklat för användning i däggdjur för att möjliggöra en fullständig perfusion och visualisering av axolotlvaskulaturen 7 . Detta protokoll beskriver de steg som tagits för att framgångsrikt perfekta och därefter visualisera axolotlcirkulationen med en DiI-färgningsteknik. Denna procedur kommer att möjliggöra exakt visualisering av patentblodkärl i homeostatiska vävnader, liksom i regenererande vävnader, och tillhandahåller en ny metod för visualizatioN och analys av revaskulariseringsprocessen i axolotl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visualisering av vaskulaturen hos axolotl kan framgångsrikt åstadkommas genom perfusion med det lipofila karbocyaninfärgämnet, DiI. I denna studie beskriver vi ett nytt protokoll för perfusion av axolotl med DiI med en peristaltisk pump. Vi visar också den efterföljande visualiseringen av axolotlvaskulaturen med hjälp av ett fluorescerande konfokalmikroskop. Detta protokoll var en anpassning av gnagare DiI-perfusionsprotokollet ses i Li et al. 7 , men stora skillnader mellan gnag…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Brigham & Women's Hospital och March of Dimes. Författarna skulle vilja tacka alla medlemmar i Whited Lab för deras stöd och råd.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
Riferimenti
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts – standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
