Préparation de vésicules membranaires plasmatiques à partir de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse pour une thérapie potentielle de remplacement du cytoplasme
Summary
Les maladies liées à l'âge sont associées à de multiples défauts dans les composants du cytoplasme. Ici, nous présentons un protocole pour préparer des vésicules à membrane plasmatique à partir de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse. Cette technique pourrait potentiellement être utilisée comme moyen de traitement de remplacement du cytoplasme pour améliorer ou même inverser les phénotypes associés à l'âge.
Abstract
Nous avons déjà signalé la génération de vésicules à membrane plasmatique (PMV) par l'extrusion mécanique de cellules de mammifères. La fusion des PMV avec des cellules Rho0 déficitaires mitochondriales a restauré l'activité mitotique dans des conditions de culture normales. L'athérosclérose, le diabète de type 2, la maladie d'Alzheimer et le cancer sont des maladies liées à l'âge qui ont été rapportées comme étant associées à de multiples défauts mécaniques et fonctionnels dans le cytosol et les organites d'une variété de types cellulaires. Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) représentent une population cellulaire unique à partir de la moelle osseuse qui possède des capacités d'auto-renouvellement tout en conservant leur multipotence. La supplémentation des cellules de sénescence avec un cytoplasme jeune provenant de BMSC autologues par fusion de PMV offre une approche prometteuse pour améliorer ou même inverser les phénotypes associés à l'âge. Ce protocole décrit comment préparer des PMV à partir de BMSC par extrusion à travers une membrane en polycarbonate avec 31, m pores, déterminent l'existence de mitochondries et examinent le maintien du potentiel de membrane dans les PMV en utilisant un microscope confocal, concentrent les PMV par centrifugation et effectuent l'injection in vivo de PMV dans le muscle gastrocnémien de la souris.
Introduction
Un énorme effort a été consacré à l'établissement d'approches pour les thérapies de remplacement des gènes, des enzymes et des cellules. Cela a entraîné de grandes percées et même des applications cliniques 1 , 2 , 3 . Récemment, une thérapie de remplacement mitochondrie controversée basée sur la technologie de transfert de noyau a été appliquée à la fécondation in vitro pour les femmes de la vieillesse ou portant une mutation de l'ADN mitochondrial létale 4 . Les défauts constatés dans les maladies liées à l'âge, y compris l'athérosclérose, le diabète de type 2, la maladie d'Alzheimer et le cancer, sont habituellement polyvalents. On a documenté que l'accumulation de gouttelettes lipidiques; Le dépôt de protéine amyloïde; La rétention des protéines dépliées dans le réticulum endoplasmique; Et le protéasome défectueux, les autophagosomes et les mitochondries contribuent au développement ou à l'aggravation de ces maladies"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . À l'heure actuelle, il n'existe aucun mécanisme disponible visant à remédier directement au dysfonctionnement du cytosol et des organites, ce qui provoque des phénotypes de sénescence et de vieillissement.
Nous avons déjà signalé la génération de vésicules à membrane plasmatique (PMV) par l'extrusion mécanique de cellules de mammifères 12 . À l'exception du noyau, des composants dans la membrane ou le cytosol, y compris les protéines et l'ARN, ainsi que les organites, comme les mitochondries, ont été trouvés dans les PMV. Essentiellement, un PMV peut être considéré comme une cellule énucléée en miniature. Plus important encore, la fusion des PMV avec des cellules Rho0 déficitaires en mitochondrie a restauré l'activité mitotique dans des conditions de culture normales. Il s'agit du premier rapport sur l'établissementUne approche potentiellement efficace pour la thérapie de remplacement du cytoplasme.
Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) sont des cellules progénitérales multipotentes qui sont générées de façon routinière à partir de la moelle osseuse et sont facilement développées en culture. Les marqueurs de cellules souches embryonnaires Oct4, Nanog et SOX2 ont été détectés à des niveaux faibles dans les MSC 13 . L'activité de la télomérase est également mesurable. En outre, l'absence de molécules co-stimulatrices et de molécules de classe II d'antigène de leucocyte humain (HLA), ainsi que d'une faible expression de HLA de classe I sur les MSC, en font des cellules idéales pour une utilisation allogénique ou "off-the-shelf" À la fois la médecine régénératrice et les applications immunomodulatrices 14 .
Ici, nous décrivons comment préparer des PMV à partir de BMSC de souris par extrusion à travers une membrane en polycarbonate avec des pores de 3 μm, déterminer l'existence de mitochondries et examiner le maintien du potentiel de membrane dans les PMV en utilisant du confocEn microscopie, préparer des PMV concentrées mais non agrégées par centrifugation et effectuer l'injection in vivo de PMV dans le muscle gastrocnémien de la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par la Fondation Li Ka Shing, le projet de l'Université de haut niveau de Guangdong "Technologies vertes pour les industries maritimes", la Fondation des sciences naturelles de la Chine (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925), et le Département de l'éducation de Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
Riferimenti
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
