הכנת שלפוחית הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה
Summary
מחלות הקשורות לגיל קשורות למספר פגמים במרכיבי הציטופלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת שלפוחית הממברנה פלזמה מתאי גזע העצם mesenchymal. טכניקה זו יכולה לשמש כאמצעי טיפולי החלפת ציטופלסמה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים.
Abstract
יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים. היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן הן מחלות הקשורות לגיל, אשר דווחו כי הן קשורות למספר פגמים מכניים ופונקציונליים בציטוזול ובאברונים של מגוון סוגי תאים. תאי גזע מוחיים mesenchymal (BMSCs) מייצגים אוכלוסיית תאים ייחודית ממח העצם, בעלת יכולות התחדשות עצמית, תוך שמירה על ריבוי המרכיבים שלהם. התוספת של תאים ההזדקנות עם cytoplasm צעירים מ BMSCs אוטולוגיים באמצעות היתוך של PMVs מספק גישה מבטיחה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין PMVs מ BMSCs באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 31, נקבוביות, לקבוע את קיומה של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתרכז PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.
Introduction
כמות עצומה של מאמץ הוקדשה להקמת גישות לטיפול בגנים, באנזים ובתאי החלפת תאים. זה הביא פריצות דרך גדולות ואפילו יישומים קליניים 1 , 2 , 3 . לאחרונה, טיפול מחליף מיטוכונדריה שנוי במחלוקת המבוסס על טכנולוגיית העברת גרעין הוחל על הפריה חוץ גופית עבור נשים בגיל מבוגר או נושא מוטציה דנ"א מיטוכונדריאלית קטלנית 4 . פגמים שנמצאו במחלות הקשורות לגיל, כולל טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן, הם לרוב רב פנים. זה כבר מתועד כי הצטברות של טיפות השומנים; את התצהיר של חלבון עמילואיד; שימור חלבונים שהתגלגלו בתוך הרשת האנדופלסמית; ו פרוטאזום פגום, autophagosome, ו המיטוכונדריה לתרום להתפתחות או להחמרה של מחלות אלה"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . כיום, אין מנגנון זמין שמטרתו תיקון ישיר של תקלה ב cytosol ו organelles, אשר גורם ההזדקנות ו פנוטיפים ההזדקנות.
יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים 12 . למעט הגרעין, נמצאו המרכיבים בממברנה או בציטוסול, כולל חלבונים ורנ"א, כמו גם את האברונים, כמו המיטוכונדריה, ב- PMV. בעיקרו של דבר, PMV יכול להיחשב לתא אנקלאציה מיניאטורי. חשוב יותר, היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. זהו הדו"ח הראשון על establiShing גישה יעילה פוטנציאלית לטיפול החלפת ציטופלסמה.
תאי גזע מוחיים mesenchymal העצם (BMSCs) הם תאים אב multipotent כי הם נוצרים באופן שגרתי ממח העצם והם מורחבים בקלות בתרבות. תאים עובריים של תאי גזע Oct4, Nanog ו- SOX2 התגלו ברמות נמוכות ב- MSC 13 . פעילות הטלומראז ניתנת למדידה. בנוסף, היעדרם של מולקולות מעוררות-גומלין ומולקולות מחלקה II של לויקוציטים אנושיים (HLA), כמו גם ביטוי נמוך של HLA Class I ב- MSC, הופכים אותם לתאים אידיאליים לשימוש באלוגני או "מדף" רפואה משובי ויישומים אימונומודולטוריים 14 .
כאן, אנו מתארים כיצד להכין PMVs מ BMSCs העכבר באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 3 מיקרוגרם הנקבוביות, לקבוע את קיומו של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה ב PMVs באמצעות קונפוקאל מיקרוסקופיה, להכין מרוכזים אך לא מצטברים PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן לי שאנג שינג, פרויקט גואנגדונג ברמה גבוהה אוניברסיטת "ירוק טכנולוגיות לתעשיות ימית", הקרן למדעי הטבע של סין (http://www.nsfc.gov.cn/ מענק מס '30971665, 81172894, 81370925), ואת מחלקת החינוך של גואנגדונג (http://www.gdhed.edu.cn/ מענק No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
Riferimenti
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
