Mesure de l'absorption de glucose et réponse à la stimulation de l'insuline dans<em> In Vitro</em> Myotubes primaires humains cultivés
Summary
Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés et les taux d'absorption du glucose sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basal et stimulés par l'insuline en utilisant du [ 3 H] 2-désoxy-D-Glucose radiomarqué.
Abstract
Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l'homéostasie du glucose. L'évaluation de la sensibilité à l'insuline des cellules musculaires est d'une importance majeure pour toutes les études consacrées à l'exploration du métabolisme du glucose musculaire et à la caractérisation des altérations métaboliques. Dans les cellules musculaires, les protéines de transporteur de glucose de type 4 (GLUT4) se transposent vers la membrane plasmique en réponse à l'insuline, ce qui permet une entrée massive de glucose dans la cellule. La capacité des cellules musculaires à répondre à l'insuline en augmentant le taux d'absorption de glucose est l'une des lectures standard pour quantifier la sensibilité des cellules musculaires à l'insuline. Les myotubes primaires humains sont un modèle in vitro approprié, car les cellules conservent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris la sensibilité à l'insuline. Ce modèle in vitro convient également pour le test de tout composé susceptible d'avoir une incidence sur la réactivité de l'insuline. Les mesures du taux d'absorption de glucose dans les myotubes différenciés reflètentSensibilité à l'insuline.
Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés, et les taux d'absorption de glucose avec et sans stimulation par l'insuline sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux de transport de glucose passifs et actifs en utilisant [ 3 H] 2-désoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG radiomarqué [2H]. Des méthodes de calcul sont fournies pour quantifier les taux basiques actifs et stimulés par l'insuline, ainsi que le pli de stimulation.
Introduction
Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l'homéostasie du glucose. Ce tissu sensible à l'insuline est le site principal de l'absorption de glucose qui est déclenchée par la stimulation de l'insuline 1 .
Dans le diabète de type 2, la résistance à l'insuline est observée dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique, et conduit à une concentration de glucose sanguin supérieure à la normale. Ainsi, il est très important de déterminer le niveau de sensibilité à l'insuline de ce tissu et de ses cellules, qu'il s'agisse de caractériser un défaut d'un sujet ou d'évaluer l'efficacité d'un traitement visant à l'améliorer. Chez les sujets humains ou animaux, la technique d'étalon-or pour évaluer la sensibilité à l'insuline est la pince hyperinsulinémique-euglycémique. Introduit par DeFronzo en 1979 2 et modifié depuis 3 , 4 alors, la méthode permet de quantifier tout le corps aLa capacité de réponse de l'insuline aux tissus est mesurée comme le taux de glucose à perfuser sous stimulation à l'insuline pour maintenir une concentration normale de glucose dans le sang.
L'exploration de la sensibilité à l'insuline peut également être effectuée au niveau des cellules en utilisant des modèles musculaires in vitro , et la mesure des taux d'absorption de glucose reste un outil efficace et fiable pour quantifier la réponse biologique de la stimulation cellulaire à l'insuline 5 , 6 , 7 . En effet, la mesure de l'absorption de glucose quantifie la réponse biologique cellulaire à la stimulation de l'insuline, de la liaison de l'insuline à son récepteur à la translocation des vésicules enrichies en GLUT4, y compris les cascades de signalisation intracellulaire et de phosphorylation 8 .
Ceci est d'un intérêt majeur pour les échantillons humains, car les myotubes différenciés maintiennent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris les propriétés métaboliquesIes et troubles observés chez le patient 9 , 10 , 11 , 12 . Les myotubes présentent des similitudes structurelles, métaboliques et phénotypiques avec le muscle squelettique 13 , 14 , y compris l'expression des transporteurs de glucose 15 et les machines de signalisation cellulaire insuline 16 . Ainsi, la mesure de l'absorption de glucose dans les myotubes primaires est pertinente pour caractériser le phénotype musculaire d'un donneur ou pour étudier l'effet d'une intervention (médicament, nutrition ou activité physique) sur la sensibilité à l'insuline dans la cellule musculaire.
La mesure de l'absorption de glucose sur les myotubes cultivés est également un outil fiable lors de l'exécution d'expériences qui modifient la sensibilité à l'insuline 17 , 18 . L' in vitro </Em> est adapté pour le test de tout composé qui pourrait améliorer la réactivité de l'insuline, ou pourrait prévenir ou inverser la résistance à l'insuline acquise ou induite 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la culture et différencions les myotubes humains et mesurons les taux d'absorption de glucose cellulaire. La méthode s'applique à toute source de cellules précurseurs musculaires humaines, qu'elles proviennent de préparations, de collaborations ou de fournisseurs commercialement disponibles dans le laboratoire. Les lignées de cellules musculaires immortalisées, comme C2C12 et L6, respectivement à partir d'origine de souris et de rat, peuvent également être utilisées pour la mesure de l'absorption de glucose avec ce protocole 7 .
Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basaux et stimulés par l'insuline en utilisant [3H] 2dG radiomarqué. TL'utilisation d'un analogue de glucose marqué permet une détermination précise de l'entrée de glucose avec un matériau de départ réduit, une condition commune lorsque vous travaillez avec des cellules primaires. La molécule de glucose modifiée est incapable d'entrer dans les voies métaboliques, et donc, s'accumule dans la cellule, permettant une quantification fiable via la radioactivité cellulaire totale. Les conditions expérimentales comprennent l'utilisation d'un inhibiteur du transport du glucose (cytochalasine B), et les mesures sont effectuées avec et sans insuline. Cette combinaison permet la détermination des taux d'entrée active du glucose, ainsi que le calcul du changement de pli pour l'indice de réponse à l'insuline. La méthode est présentée avec une dose d'insuline pendant un seul temps d'incubation, mais le protocole peut être facilement modifié pour des expériences de réponse à la dose ou de temps 12 .
Protocol
Representative Results
Discussion
L'absorption de glucose est une mesure biologique clé pour tester les activateurs ou les inhibiteurs de la culture cellulaire et leur impact sur l'utilisation du glucose et la capacité de la cellule à répondre à l'insuline. La méthode décrite ici s'est révélée rapide et fiable et a été largement utilisée dans de nombreuses études utilisant des myotubes primaires de sujets sains et / ou métaboliquement affectés 6 , 7 , <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent Anne Charrié au service de Radiobiologie (hôpital de Lyon-Sud) et Fond National Suisse (FNS) pour leur soutien financier.
Materials
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
Riferimenti
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