Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em> Rhipicephalus microplus</em> Epithel-Darmzellen
Summary
Eine modifizierte Dichte-Zentrifugations-Gradienten-basierte Methodik wurde verwendet, um Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus- Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetperlen zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt.
Abstract
Rhipicephalus microplus – die Rindertick – ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomischen Auswirkungen auf Viehbestand als Vektor von mehreren Krankheitserregern. Bemühungen wurden der Vieh-Tick-Kontrolle gewidmet, um ihre schädlichen Wirkungen zu verringern, wobei der Fokus auf die Entdeckung von Impfstoffkandidaten wie BM86, die sich auf der Oberfläche der Tick-Darm-Epithelzellen befinden, Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Nutzung von cDNA und genomischen Bibliotheken, um für andere Impfstoffkandidaten zu screenen. Die Isolierung von Tick-Darmzellen stellt einen wichtigen Vorteil bei der Untersuchung der Zusammensetzung von Oberflächenproteinen auf der Tick-Darm-Zellmembran dar. Dieses Papier stellt eine neuartige und machbare Methode für die Isolierung von Epithelzellen dar, von den Tick-Darm-Inhalten von halb engorgestem R. microplus . Dieses Protokoll nutzt TCEP und EDTA, um die Epithelzellen aus dem subepithelialen Stützgewebe und einem diskontinuierlichen Dichtezentrifugationsgradie freizusetzenNt, um Epithelzellen aus anderen Zelltypen zu trennen. Zelloberflächenproteine wurden biotinyliert und aus den Tick-Darm-Epithelzellen isoliert, wobei Streptavidin-verknüpfte magnetische Perlen verwendet wurden, die nachgeschaltete Anwendungen in FACS- oder LC-MS / MS-Analyse erlaubten.
Introduction
Rhipicephalus microplus , die Viehzuttel, ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomische Auswirkung auf die Viehwirtschaft der tropischen und subtropischen Regionen, da sie Rinder-Tick-Fieber (Babesiose), Anaplasmose und pferdeartige Piroplasmose 1 , 2 , 3 , 4 . Es wurden Anstrengungen zur Rindertickkontrolle unternommen, um die schädliche Wirkung zu verringern, aber herkömmliche Verfahren wie die Verwendung von chemischen Akariziden haben implizite Nachteile, wie das Vorhandensein von chemischen Rückständen in Milch und Fleisch und die Zunahme der Prävalenz von chemisch resistenten Zecken 5 , 6 , 7 Folglich wurde die Entwicklung alternativer Methoden der Zeckenkontrolle untersucht, wie die Verwendung von natürlichen Resistenzvieh, biologische Kontrolle (Biopestizide) und VaccInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
Bei der Verfolgung von Proteinen, die als Impfstoffkandidaten verwendet werden können, konzentriert sich die aktuelle Forschung auf den Tick Darm. Die Mittelgutwand ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen aufgebaut, die auf einer dünnen Basallamelle ruht, wobei die Außenseite der Basallamina ein Netz von Muskeln bildet. Licht- und Elektronenmikroskop Beobachtungen zeigen, dass die Midgut besteht aus drei Arten von Zellen: Reserve (undifferenziert), sekretorischen und Verdauung. Die Anzahl der Zelltypen variiert in Abhängigkeit von der physiologischen Phase erheblich. Sekretorische und Verdauungszellen stammen beide aus Reservezellen 18 , 19 , 20 .
Der Aufbau von cDNA-BibliothekenUm die Zusammensetzung des Zeckendarms zu untersuchen, hat zur Identifizierung von antigenen Proteinen wie Bm86 als potentielle Impfstoffkandidaten 2 , 3 , 4 geführt . Das Glykoprotein Bm86 ist an der Oberfläche der Tick-Darmzellen lokalisiert und induziert eine schützende Immunantwort gegen die Rindertick ( R. microplus ) bei geimpften Rindern. Anti-Bm86-IgGs, die durch den immunisierten Wirt produziert werden, werden von der Zecke eingenommen, erkennen dieses Antigen auf der Oberfläche von Tick-Darmzellen und stören anschließend die Tick-Darm-Gewebefunktion und die Integrität. Impfstoffe basieren auf Bm86 Antigene wirksame Kontrolle von R. micro und Rhipicephalus annulatus, in einem reduzierten Larvenbefall durch die Verringerung der Zahl, Gewicht und Fortpflanzungsfähigkeit von Verschlingen Weibchen, was 4 in nachfolgenden Generationen tick gezeigt. Allerdings sind Bm86-basierte Impfstoffe nicht wirksam gegen alle Tick-Stufen und habenZeigte eine unbefriedigende Wirksamkeit gegen einige geographische Stämme von R. microplus , folglich haben die Rindfleisch- und Milchindustrie diese Impfstoffe schlecht angenommen 2 , 4 .
Die Fähigkeit, Epithelzellen aus dem Tick-Darm zu isolieren, ist eine signifikante Innovation, die es ermöglicht, die Projektion der Forschung zu bestimmen, um die Proteinmembranzusammensetzung einschließlich Morphologie und Physiologie unter verschiedenen Umgebungsbedingungen zu bestimmen. Das hier beschriebene Verfahren verwendet den Chelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und das Reduktionsmittel Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP), um das Epithel aus seinen subepithelialen Trägergeweben 10 freizusetzen. Das Epithel wird nach mechanischer Zerstörung der Gewebe durch Schütteln gewonnen, gefolgt von einer diskontinuierlichen Gradientenzentrifugation in Percoll. Dieses Papier beschreibt eine machbare und neuartige Technik für die Isolierung von Tick Darm epiThelialen Zellen Biotinylierte Zelloberflächenproteine, die von der Oberfläche dieser Epithelzellen isoliert wurden, können anschließend in nachgeschalteten Anwendungen wie FACS und / oder LC-MS / MS-Analyse analysiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vieh-Tick-Befall stellt ein großes Problem für die Viehwirtschaft in tropischen und subtropischen Regionen der Welt dar, wobei die gängigste Methode der Kontrolle von der Verwendung von Akariziden 1 , 4 abhängig ist. Bm86 wurde zuvor innerhalb der Tick-Darm-Epitheloberfläche als Schutz-Antigen gegen R. microplus- Befall 10 identifiziert, mit begrenztem Erfolg als Impfstrategie aufgrund der Bm86-geographischen Sequenzvariatio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten den Biosicherheit Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fischerei, Australien) für die Bereitstellung von Rhipicephalus Zecken micro für diese Studie verwendet, und Lucas Karbanowicz für die Unterstützung bei der Videoaufnahme danken.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
Riferimenti
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