बायोटिनिलाटेड सेल सतह प्रोटीन की शुद्धि<em> राइप्सीफलस माइक्रोप्रलस</em> एपिथेलियल पेट कोशिकाओं
Summary
एक संशोधित घनत्व केन्द्रापसारक ढाल-आधारित पद्धति का उपयोग रिप्चिफ्ल्यस मायक्रोप्लस आंत ऊतक से उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया था। भूतल-बाध्य प्रोटीन बायोटिनिलाटेड थे और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए स्ट्रेक्टिविडिन चुंबकीय मोतियों के माध्यम से शुद्ध थे।
Abstract
Rhipicephalus microplus – पशु टिक – पशुधन पर आर्थिक प्रभाव के संदर्भ में कई रोगजनकों के एक सदिश के रूप में सबसे महत्वपूर्ण एक्टोपैरासाइट है। टीक पेट के उपकला कोशिकाओं की सतह पर स्थित बीएम 86 जैसे वैक्सीन उम्मीदवारों की खोज पर ध्यान देने के साथ, अपने विकृति प्रभाव को कम करने के लिए पशु टिक नियंत्रण को समर्पित किया गया है। वर्तमान शोध सीडीएनए और जीनोमिक पुस्तकालयों के इस्तेमाल पर केंद्रित है, अन्य टीसी उम्मीदवारों के लिए स्क्रीन पर। टिक आंत कोशिकाओं के अलगाव को सतह के प्रोटीन की संरचना की जांच में एक महत्वपूर्ण लाभ होता है जो टिक आंत कोशिका झिल्ली पर होता है। इस पत्र में उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपन्यास और व्यावहारिक विधि का गठन होता है, अर्ध-संक्रमित आर। माइक्रोप्रलस की टिक पेट सामग्री से । यह प्रोटोकॉल टीसीईपी और ईडीटीए का उपयोग करता है जो उपकलाशोथ समर्थन ऊतकों से उपकला कोशिकाओं को जारी करता है और एक असंतत घनत्व केन्द्रापसारक ग्रेडिअन्य सेल प्रकारों से उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए NT एफएसीएस या एलसी-एमएस / एमएस-विश्लेषण में डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस के लिए अनुमति देने वाली स्ट्रेक्टिविडिन से जुड़े चुंबकीय मोती का उपयोग करते हुए, सेल की सतह प्रोटीन बायोटिकिनिलाटेड और टिक आंत उपकला कोशिकाओं से पृथक थे।
Introduction
उष्णकटिबंधीय और उप-उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों के मवेशी उद्योग पर आर्थिक प्रभाव के संदर्भ में, रिप्शिफ्लस माइक्रोप्रलस , पशु टिक, सबसे महत्वपूर्ण एक्टोपैरासाइट है, क्योंकि यह वाइटर बोवाइन टिक फिवर (बैलिओसिस), एनाप्लाज्मोसिस और इक्वाइन पिरोप्लाज्मोसिस 1 , 2 , 3 , 4 । हानिकारक प्रभाव को कम करने के लिए, पशुओं के नियंत्रण को नियंत्रित करने के लिए प्रयास किया गया है, हालांकि रासायनिक एड़ारिकाइड्स के उपयोग के रूप में पारंपरिक तरीकों में अंतर्निहित कमियां हैं, जैसे कि दूध और मांस में रासायनिक अवशेषों की उपस्थिति और रासायनिक प्रतिरोधी टिक्ल्स के प्रसार में वृद्धि 5 , 6 , 7 नतीजतन, टिक नियंत्रण के वैकल्पिक तरीकों का विकास किया गया है, जैसे कि प्राकृतिक प्रतिरोधी मवेशी, जैविक नियंत्रण (बायोपेस्टीसाइड) और वैक्सीन का उपयोगइनस 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9
वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में उपयोग किए जाने वाले सक्षम प्रोटीनों की खोज में, वर्तमान शोध में टिक पेट पर ध्यान केंद्रित किया गया है। मिडगुत की दीवार पतली बेसल लैमीना पर आराम कर रहे उपकला कोशिकाओं की एक परत से बनाई गई है, जिसमें बेसल लैमीना के बाहर मांसपेशियों के एक नेटवर्क का निर्माण होता है। लाइट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप अवलोकनों से पता चलता है कि मिडगुट में तीन प्रकार के कोशिकाएं हैं: आरक्षित (undifferentiated), स्राट्री, और पाचन शारीरिक प्रकार की संख्या के आधार पर सेल प्रकार की संख्या काफी भिन्न होती है। सेक्रेटरी और पाचन कोशिकाओं दोनों रिजर्व कोशिकाओं से उत्पन्न 18 , 1 9 , 20
सीडीएनए पुस्तकालयों का निर्माणटिकटिक पेट की संरचना की जांच के लिए संभावित बीजाणु उम्मीदवारों 2 , 3 , 4 के रूप में बीएम 86 जैसे एंटीजेनिक प्रोटीनों की पहचान करने के लिए प्रेरित किया गया है। ग्लाइकोप्रोटीन बीएम 86 को टिक आंत कोशिकाओं की सतह पर स्थानांतरित किया जाता है और टीके लगाए गए मवेशियों में पशु टिक ( आर। माइक्रोप्रलस ) के खिलाफ एक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है। प्रतिरक्षित मेजबान द्वारा उत्पादित एंटी-बीएम 86 आईजीजी टिकटिक द्वारा निगमित होते हैं, टिक एट कोशिकाओं की सतह पर इस एंटीजन को पहचानते हैं, और बाद में टिक पेट टिशू फ़ंक्शन और अखंडता को परेशान करते हैं। Bm86 एंटीजन पर आधारित टीके संख्या, वजन और महिलाओं को संतुष्ट कर, बाद में टिक पीढ़ियों 4 में एक कम लार्वा संक्रमण में जिसके परिणामस्वरूप की प्रजनन क्षमता को कम करके, आर microplus और Rhipicephalus annulatus के प्रभावी नियंत्रण से पता चला है। हालांकि, बीएम 86 आधारित टीके सभी टिक चरणों के खिलाफ प्रभावी नहीं हैं औरआर माइक्रोप्र्लस के कुछ भौगोलिक उपभेदों के खिलाफ असंतोषजनक प्रभाव का प्रदर्शन किया, फलस्वरूप बीफ़ और डेयरी उद्योगों ने इन टीकों को 2 , 4 को खराब तरीके से अपनाया है।
टिक गट से उपकला कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण नवीनता है जो विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में आकारिकी और शरीर विज्ञान सहित प्रोटीन झिल्ली संरचना को निर्धारित करने के लिए अनुसंधान की प्रगति को सक्षम करेगा। यहां वर्णित विधि उप-उपकला समर्थन ऊतक 10 से एपिथेलियम को रिलीज करने के लिए चेलेटिंग एजेंट एथिलीनएमीनियानेटेट एसिड एसिड (ईडीटीए) और कम करने वाला एजेंट ट्राइस (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फ़िन (टीसीईपी) का इस्तेमाल करता है। पेसोल में ऊतक के यांत्रिक विघटन के बाद एपिथेलियम को ठीक किया जाता है, इसके बाद पेरोल में असंतत ढाल केन्द्रापसारक होता है। इस पत्र में टिक गट एपी के अलगाव के लिए एक व्यावहारिक और उपन्यास तकनीक का वर्णन किया गया हैद कोशिकाएं इन उपकला कोशिकाओं की सतह से अलग biotinylated सेल की सतह प्रोटीन, बाद में एफएसीएस और / या एलसी-एमएस / एमएस-विश्लेषण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में विश्लेषण किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मवेशी टिक के उल्लंघन ने विश्व के उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में पशु उद्योग के लिए एक बड़ी समस्या का गठन किया है, जो कि Acaricides 1 , 4 के उपयोग पर नियंत्रण के सबसे आम तरीका ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों वीडियो फिल्माने के साथ सहायता के लिए Rhipicephalus microplus के प्रावधान इस अध्ययन के लिए उपयोग किया ticks के लिए Biosecurity टिक कॉलोनी (कृषि एवं मत्स्य पालन, क्वींसलैंड विभाग ऑस्ट्रेलिया) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और लुकास Karbanowicz।
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
Riferimenti
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