Rensing av biotinylerte celleoverflateproteiner fra<em> Rhipicephalus microplus</em> Epiteliale gutceller
Summary
En modifiserings-sentrifugeringsgradientbasert metodikk ble benyttet for å isolere epitelceller fra Rhipicephalus microplus gut-vev. Overflatbundne proteiner ble biotinylert og renset gjennom streptavidinmagnetiske perler for utnyttelse i nedstrømsapplikasjoner.
Abstract
Rhipicephalus microplus – storfemarken – er den mest betydningsfulle ektoparasitten når det gjelder økonomisk innvirkning på husdyr som vektor av flere patogener. Arbeidet har vært dedikert til storfekontrollen for å redusere skadelige virkninger, med fokus på oppdagelsen av vaksinekandidater, som BM86, plassert på overflaten av tarmgassepitelceller. Nåværende forskning fokuserer på utnyttelsen av cDNA og genomiske biblioteker, for å skjerme for andre vaksine kandidater. Isoleringen av tarmkanalceller utgjør en viktig fordel ved å undersøke sammensetningen av overflateproteiner på tarmmuskulaturmembranen. Dette papiret utgjør en ny og mulig metode for isolering av epitelceller, fra tarmhullinnholdet til halvglasset R. microplus. Denne protokollen utnytter TCEP og EDTA for å frigjøre epitelceller fra subepitelial støttevev og en diskontinuerlig tetthets-sentrifugeringsgradieNt å separere epitelceller fra andre celletyper. Celleoverflateproteiner ble biotinylert og isolert fra epitelceller fra tarmgitt, ved bruk av streptavidin-bundet magnetiske perler som tillater nedstrømsapplikasjoner i FACS- eller LC-MS / MS-analyse.
Introduction
Rhipicephalus microplus , storfemarken, er den mest betydningsfulle ektoparasiten når det gjelder økonomisk innvirkning på storfeindustrien i tropiske og subtropiske regioner, da det vektorer oksekjøtt feber (babesiosis), anaplasmosis og equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 . Arbeidet har vært viet til tyrkekontroll, for å redusere skadelig effekt, men konvensjonelle metoder som bruk av kjemiske akaricider har implisitte ulemper, som for eksempel forekomst av kjemiske rester i melk og kjøtt, og økningen i utbredelsen av kjemisk resistente flått 5 , 6 , 7 . Følgelig har utviklingen av alternative metoder for tikkontroll blitt undersøkt, slik som bruk av naturlig resistenskveg, biologisk kontroll (biopesticider) og vaksineInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
I jakten på proteiner som kan benyttes som vaksine kandidater, er dagens forskning fokusert på tarmgutten. Midgutveggen er bygd av et enkelt lag av epitelceller som hviler på en tynn basal laminat, med utsiden av basallamina som danner et nettverk av muskler. Lys- og elektronmikroskopobservasjoner indikerer at midguten består av tre typer celler: reserve (utifferentiert), sekretorisk og fordøyelseskanal. Antall celletyper varierer vesentlig avhengig av den fysiologiske fasen. Sekretoriske og fordøyelsesceller oppstår begge fra reserveceller 18 , 19 , 20 .
Konstruksjonen av cDNA-bibliotekerFor å undersøke sammensetningen av tarmkanalen har ført til identifisering av antigeniske proteiner, slik som Bm86, som potensielle vaksinekandidater 2 , 3 , 4 . Glykoproteinet Bm86 er lokalisert på overflaten av tarmkanalceller og fremkaller en beskyttende immunrespons mot storfemarken ( R. microplus ) hos vaksinert storfe. Anti-Bm86 IgG produsert av den immuniserte verten inntas av tippen, gjenkjenner dette antigenet på overflaten av tarmgutceller, og forstyrrer deretter tarmgassvevsfunksjon og integritet. Vaksiner basert på Bm86 antigener har vist effektiv kontroll av R. microplus og Rhipicephalus annulatus ved å redusere antall, vekt og reproduksjonskapasitet hos engorging kvinner, noe som resulterer i redusert larveinfeksjon i etterfølgende kryssgenerasjoner 4 . Bm86-baserte vaksiner er imidlertid ikke effektive mot alle kryssfaser og harViste utilfredsstillende effekt mot noen geografiske stammer av R. microplus , og derfor har biff- og meieriindustrien dårlig tatt disse vaksinene 2 , 4 .
Evnen til å isolere epitelceller fra tarmgutten er en signifikant innovasjon som vil muliggjøre fremdriften av forskning for å bestemme proteinmembranblandingen, inkludert morfologi og fysiologi under forskjellige miljøforhold. Fremgangsmåten beskrevet her anvender chelateringsmiddeletylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og reduksjonsmiddelet tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) for å frigjøre epitelet fra dets subepiteliale støttevev 10 . Epitelet gjenvinnes etter mekanisk forstyrrelse av vevet ved risting, etterfulgt av diskontinuerlig gradient-sentrifugering i Percoll. Dette papiret beskriver en gjennomførbar og ny teknikk for isolering av tick gut epiTelleceller. Biotinylerte celleoverflateproteiner, isolert fra overflaten av disse epitelceller, kan deretter analyseres i nedstrømsapplikasjoner som FACS og / eller LC-MS / MS-analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvegkreftinfeksjoner utgjør et stort problem for storfeindustrien i tropiske og subtropiske regioner i verden, med den vanligste kontrollmetoden som er avhengig av bruk av akaricider 1 , 4 . Bm86 ble tidligere identifisert innenfor epitelflaten til tarmgutten som et beskyttende antigen mot R. microplus infestation 10 , med begrenset suksess som en vaksine strategi på grunn av Bm86 geografisk sekvensvariasjon og kravet om regelm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australia) for levering av Rhipicephalus microplus ticks brukt til denne studien, og Lucas Karbanowicz for hjelp med videoopptak.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
Riferimenti
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. . Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. . "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , (1983).
