Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em> Rhipicephalus microplus</em> Células intestinais epiteliais
Summary
Utilizou-se uma metodologia baseada em gradiente de centrifugação por densidade modificada para isolar células epiteliais do tecido intestinal de Rhipicephalus microplus . As proteínas ligadas à superfície foram biotiniladas e purificadas através de esferas magnéticas de estreptavidina para utilização em aplicações a jusante.
Abstract
Rhipicephalus microplus – o carrapato do gado – é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico sobre o gado como um vetor de vários agentes patogênicos. Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado para diminuir seus efeitos deletérios, com foco na descoberta de vacinas candidatas, como o BM86, localizado na superfície das células epiteliais do intestino do carrapato. Pesquisa atual enfoca a utilização de bibliotecas de cDNA e genômicas, para pesquisar outras vacinas candidatas. O isolamento das células intestinais do carrapato constitui uma vantagem importante na investigação da composição das proteínas superficiais sobre a membrana das células intestinais do carrapato. Este artigo constitui um método inovador e viável para o isolamento de células epiteliais, a partir dos índices de intestino de carvão de R. microplus semi-engrossado . Este protocolo utiliza TCEP e EDTA para libertar as células epiteliais dos tecidos de suporte subepitelial e um gradiente de centrifugação de densidade descontínuaNt para separar as células epiteliais de outros tipos de células. As proteínas da superfície celular foram biotiniladas e isoladas das células epiteliais intestinais do carrapato, utilizando grânulos magnéticos ligados à estreptavidina, permitindo aplicações a jusante em FACS ou LC-MS / MS-analysis.
Introduction
Rhipicephalus microplus , o carrapato do gado, é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico na indústria pecuária de regiões tropicais e subtropicais, na medida em que eleva a febre do carrapato bovino (babesiose), anaplasmose e piroplasmose equina 1 , 2 , 3 , 4 . Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado, para diminuir o efeito deletério, no entanto, os métodos convencionais, como o uso de acaricidas químicos, apresentam desvantagens implícitas, como a presença de resíduos químicos no leite e a carne e o aumento da prevalência de carrapatos quimicamente resistentes 5 , 6 , 7 . Conseqüentemente, o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de tiquetaque foi estudado, como o uso de bovinos de resistência natural, controle biológico (biopesticidas) e vacinaInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
Na busca de proteínas capazes de serem utilizadas como vacinas candidatas, a pesquisa atual é focada no intestino do carrapato. A parede do intestino médio é construída a partir de uma única camada de células epiteliais descansando sobre uma lâmina basal fina, com a parte externa da lâmina basal formando uma rede de músculo. As observações de luz e microscópio eletrônico indicam que o intestino médio consiste de três tipos de células: reserva (indiferenciada), secreção e digestivo. O número de tipos de células varia consideravelmente dependendo da fase fisiológica. As células secretoras e digestivas originam-se das células de reserva 18 , 19 , 20 .
A construção de bibliotecas de cDNAPara examinar a composição do intestino do carrapato levou à identificação de proteínas antigênicas, como o Bm86, como potenciais candidatos à vacina 2 , 3 , 4 . A glicoproteína Bm86 está localizada na superfície das células intestinais do carrapato e induz uma resposta imune protetora contra o carrapato do gado ( R. microplus ) no gado vacinado. As IgG anti-Bm86 produzidas pelo hospedeiro imunizado são ingeridas pelo carrapato, reconhecem este antígeno na superfície das células intestinais do carrapato e, posteriormente, perturbam a função e integridade do tecido intestinal. As vacinas baseadas em antígenos Bm86 mostraram controle efetivo de R. microplus e Rhipicephalus annulatus, reduzindo o número, peso e capacidade reprodutiva das fêmeas envolventes, resultando em uma infestação larval reduzida nas gerações subseqüentes do carrapato 4 . No entanto, as vacinas baseadas em Bm86 não são eficazes contra todos os estádios de carrapatos e têmDemonstraram eficácia insatisfatória contra algumas cepas geográficas de R. microplus , conseqüentemente as indústrias de carne bovina e láctea adotam mal estas vacinas 2 , 4 .
A capacidade de isolar células epiteliais do intestino do carrapato é uma inovação significativa que permitiria a progressão da pesquisa para determinar a composição da membrana protéica, incluindo morfologia e fisiologia sob diferentes condições ambientais. O método aqui descrito utiliza o agente de quelação de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o agente redutor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para libertar o epitélio dos seus tecidos de suporte subepitelial 10 . O epitélio é recuperado após a ruptura mecânica dos tecidos por agitação, seguida de centrifugação descontínua gradiente em Percoll. Este artigo descreve uma técnica viável e inovadora para o isolamento do intestino intestinal epiCélulas celulares. As proteínas de superfície celular biotiniladas, isoladas a partir da superfície destas células epiteliais, podem subsequentemente analisar em aplicações a jusante tais como análise de FACS e / ou LC-MS / MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
As infestações por carrapatos de gado constituem um grande problema para a indústria do gado em regiões tropicais e subtropicais do mundo, com o método de controle mais comum dependendo do uso de acaricidas 1 , 4 . O Bm86 foi previamente identificado dentro da superfície epitelial do intestino do carrapato como um antígeno protetor contra a infestação de R. microplus 10 , com sucesso limitado como estratégia de vacina d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer a Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Austrália) para a prestação de carrapatos Rhipicephalus microplus utilizados para este estudo e Lucas Karbanowicz para assistência em video-filmagem.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
Riferimenti
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