यह प्रोटोकॉल लंबी अवधि के पूर्व vivo संस्कृति और एक ड्रोसोफिला imaginal डिस्क के लाइव इमेजिंग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन है। यह फोटोरिसेप्टर भेदभाव और ommatidial रोटेशन आंख डिस्क की लाइव इमेजिंग के 10 घंटे की अवधि के भीतर दर्शाता है। प्रोटोकॉल सरल है और महंगा सेटअप की आवश्यकता नहीं है।
लाइव इमेजिंग लगातार वास्तविक समय में गतिशील सेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं ट्रैक करने की क्षमता प्रदान करता है। ड्रोसोफिला लार्वा imaginal डिस्क जैसे सेल प्रसार, भेदभाव, विकास, प्रवास, apoptosis, प्रतियोगिता, सेल कोशिका संकेतन, और पूरक सीमा गठन के रूप में कई जैविक प्रक्रियाओं, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, लंबी अवधि के पूर्व vivo संस्कृति और imaginal डिस्क की लाइव इमेजिंग के लिए तरीके संतोषजनक नहीं किया गया है, कई प्रयासों के बावजूद। हाल ही में, हम लंबे समय तक पूर्व vivo संस्कृति और अप करने के लिए 18 घंटे के लिए imaginal डिस्क की लाइव इमेजिंग के लिए एक विधि विकसित की। संस्कृति माध्यम में एक उच्च इंसुलिन एकाग्रता का उपयोग कर के अलावा, एक कम पिघलने agarose भी यह इमेजिंग अवधि के दौरान बहने से रोकने के लिए डिस्क एम्बेड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस रिपोर्ट में एक उदाहरण के रूप आंख antennal डिस्क का उपयोग करता है। फोटोरिसेप्टर R3 / 4-विशिष्ट mδ0.5-Ga4 अभिव्यक्ति है कि फोटोरिसेप्टर एडवेंचर्स प्रदर्शित करने के लिए पीछा किया गया थाtiation और ommatidial रोटेशन एक 10 घंटे लाइव इमेजिंग अवधि के दौरान देखा जा सकता है। यह एक विस्तृत इस सरल विधि का वर्णन प्रोटोकॉल है।
ड्रोसोफिला लार्वाल कॉम्प्लेन्टल डिस्क जैविक तंत्र की एक विस्तृत विविधता के अध्ययन के लिए एक पसंदीदा प्रायोगिक प्रणाली रही है। ये डिस्क भ्रूणिक उपकला से निकलते हैं और दो उपकला परतों, पेरीपोडियल एपीथेलियम (पीई) और डिस्क प्रोपर (डीपी) 1 , 2 द्वारा निर्मित सैक-जैसे संरचना बनती हैं। लार्वा और पिल्चर चरण के दौरान कल्पनाशील डिस्क कोशिकाएं पैदा होती हैं और धीरे-धीरे अंतर करती हैं और अंततः वयस्क शरीर संरचनाओं में विकसित होती हैं। इम्प्लिंक डिस्क्स के फ्लैट और सरल दो-स्तरीय संरचना के कारण, लार्वा से विच्छेदित किए जाने पर वे आसानी से देख सकते हैं। हालांकि, कई समूहों के कई प्रयासों के बावजूद, कल्पनात्मक डिस्क की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए मौजूदा तरीकों संतोषजनक नहीं हैं। हमने हाल ही में एक संस्कृति पद्धति विकसित की है जो 18 घंटे तक कई कल्पित डिस्क के सामान्य विकास को बनाए रख सकती है और वह लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है 3 </s> ऊपर। संस्कृति विधि सेल भेदभाव और प्रवास का समर्थन कर सकते, लेकिन यह केवल 7-12 घंटे के लिए कोशिका प्रसार समर्थन कर सकते हैं और डिस्क विकास का समर्थन नहीं कर सकते। संस्कृति माध्यम में प्रमुख अंतर यह इंसुलिन 3 की उच्च सांद्रता है। विधि सरल है, और कोई विशेष वातन या मध्यम परिसंचरण की आवश्यकता है।
सबसे अच्छा अध्ययन किया imaginal डिस्क में से एक आंख antennal डिस्क है। ड्रोसोफिला आंख के लगभग 800 ommatidia बनाया गया है। प्रत्येक ommatidium आठ फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं (आर 1-R8) से मिलकर बना है। लार्वा आंख डिस्क में, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं Morphogenetic कुंड (एमएफ) है, जो पीछे से आंख डिस्क भर में स्वीप के पारित होने के 4, 5 पूर्वकाल के लिए निम्नलिखित को अलग करें। एक ommatidium में फोटोरिसेप्टर अनुक्रम में अंतर, R8, आर 2 / आर 5, R3 / R4, आर 1 / R6, और R7 6 द्वारा पीछा के साथ शुरुआत। पृष्ठीय में ommatidia और veआंख डिस्क की ntral हिस्सों विपरीत दिशाओं में एक 90 डिग्री रोटेशन से गुजरना, विपरीत दाहिनी 7, 8 में जिसके परिणामस्वरूप। रोटेशन प्रक्रिया दो चरणों में होता है: पहला, एक 45 ° रोटेशन पर शुरू होता है और एमएफ पीछे छठे ommatidia पंक्ति में पूरा हो गया है; दूसरा 45 ° रोटेशन पंक्ति 16 9, 10 के बारे में पूरा हो गया है। R3 / 4-विशिष्ट mδ0.5-Ga4 11 द्वारा चिह्नित ommatidial रोटेशन का इस्तेमाल किया इस अध्ययन, सामान्य सेलुलर भेदभाव और गतिशीलता है कि संस्कृति के लिए इस विधि के माध्यम से देखा जा सकता है का प्रदर्शन और जीने की छवि आंख डिस्क को।
इस अध्ययन में, हम ड्रोसोफिला imaginal डिस्क पर एक लंबे समय तक जीना इमेजिंग प्रयोग की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम सावधान विच्छेदन डिस्क क्षति से बचने के लिए और डिस्क coverslips के पास की कुर्की के लिए अनुमति देने के लिए अभ्यास में बहुत समय बिताया। हम पाली-एल लाइसिन (पीएलएल) और कम पिघलने agarose की कोशिश की ऊतक धारण करने के लिए; अंत में, कम पिघलने agarose ऊतक धारण करने के लिए एक बेहतर क्षमता दिखाई। हालांकि केवल आंख डिस्क इस पत्र में इस्तेमाल किया गया था 10 घंटे लाइव इमेजिंग अवधि के दौरान फोटोरिसेप्टर भेदभाव और ommatidial रोटेशन की सामान्य घटना प्रदर्शित करने के लिए इस पद्धति से कम से कम एक अन्य डिस्क, विंग डिस्क को, के रूप में एक में प्रदर्शन लागू किया जा सकता पिछले अध्ययन 3। इसके अलावा, संवर्धन माध्यम तैयारी और लाइव इमेजिंग सेटअप सरल कर रहे हैं और वातन या मध्यम परिसंचरण की आवश्यकता नहीं है।
सतत लाइव इमेजिंग जैविक पूर्व संध्या का एक स्पष्ट अस्थायी अनुक्रम प्रदान कर सकते हैंएनटीएस। Glia भेदभाव और आंख डिस्क में प्रवास के हमारे पहले रिपोर्ट में, हम प्रत्यक्ष प्रमाण है कि लपेटकर glia आंख डिस्क 3 के पूर्वकाल की ओर पलायन के बाद मौजूदा glia से अलग प्रदान की है। लंबे समय तक पूर्व vivo संस्कृति ऐसी Kaede फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तस्वीर-रूपांतरण के रूप में कोशिकाओं, के विशिष्ट लेजर सक्रिय लेबलिंग उनके व्यवहार 3 का पालन करने के लिए अनुमति देता है। यह भी रसायन होते हैं जो सीधे संवर्धन माध्यम में जोड़ा जाता है के परीक्षण के समायोजित कर सकते हैं; इस प्रकार, यह एक दवा स्क्रीनिंग मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। के बाद से कुछ गतिशील प्रक्रिया मिनट या सेकंड के भीतर हो, उच्च अस्थायी संकल्प की आवश्यकता है। लौकिक संकल्प, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी 15, 16 या कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी 17 बढ़ाने के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है।
वर्तमान संस्कृति हालत सही नहीं है। यह डिस्क वृद्धि का समर्थन नहीं करता। सेल पीroliferation केवल अप करने के लिए 12 घंटे 3 के लिए समर्थित है। पूर्व vivo संस्कृति में 12 घंटे के बाद, फोटोरिसेप्टर भेदभाव की दर 3 कम करने के लिए शुरू होता है। यह कुछ पोषक तत्वों या हार्मोन की कमी के कारण हो सकता है। चूंकि यह संस्कृति माध्यम में प्रमुख अंतर यह इंसुलिन के उच्च एकाग्रता है, स्तनधारी इंसुलिन आंशिक रूप से अंतर्जात इन्सुलिन जैसे पेप्टाइड्स के समारोह नकल उतार हो सकता है। मक्खी निकालने, कीट रक्त शर्करा trehalose, और molting हार्मोन 20 hydroxyecdysone के विभिन्न एकाग्रता के अलावा, लाभकारी 3 नहीं थे। हालांकि, 12-18 ज संस्कृति अवधि कई विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त है। लार्वा imaginal डिस्क संवर्धन के लिए वैकल्पिक तरीकों संवर्धन 3 तुलना की गई है, और हमारे संवर्धन और इमेजिंग हालत लंबे समय खिड़की और लाइव इमेजिंग के लिए सबसे स्पष्टता प्रदान करता है। हालांकि लाइव लार्वा और प्यूपा भीतर डिस्क सीधे imaged किया जा सकता है18, 19, 20, 21, 22, टिप्पणियों के लिए संकल्प और समय खिड़की सीमित हैं। देर लार्वा और पोटा संबंधी डिस्क एक लंबे समय के 23, 24 के लिए संवर्धित किया जा सकता है लेकिन डिस्क महत्वपूर्ण morphogenesis गुज़रना पड़ता है। सपाट, 2D लार्वा डिस्क का लाभ लेने के लिए, हमारे संवर्धन और इमेजिंग विधि अब तक सबसे अच्छा समाधान है।
The authors have nothing to disclose.
हम मक्खी खाना बनाने और बनाए रखने मक्खी शेयरों के लिए चुन-लैन सू और यु-ची यांग के लिए आभारी हैं, और सु-पिंग ली और कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी मदद के लिए आईएमबी इमेजिंग कोर करने के लिए। इस अध्ययन YHS (एनएससी के लिए 101-2321-B-001 -004, एनएससी 100-2321-B-001 -012, एनएससी 102-2321-B-001 -002, सबसे 103-2311-B-001 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया -035 -MY3) राष्ट्रीय विज्ञान परिषद और विज्ञान और रिपब्लिक ऑफ चाइना का प्रौद्योगिकी मंत्रालय से।
Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |