Denne artikkelen presenterer en optimalisert gjær østrogen skjermen for kvantifisere ligander i personlig pleieprodukter (PCPs) som binder østrogen reseptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden inneholder to kolorimetrisk substrat alternativer, en seks dagers nedkjølt inkubasjonstiden for bruk i undervisning kurs og statistiske verktøy for dataanalyse.
Gjær østrogen skjermen (Ja) brukes til å oppdage estrogenic ligander i miljøprøver og har vært grovt brukt i studier av endokrine forstyrrelser. Estrogenic ligander inkluderer både naturlige og menneskeskapte “miljømessige østrogener” (EØS) funnet i mange konsumvarer inkludert personlig pleieprodukter (PCPs), plast, plantevernmidler og mat. EØS forstyrre hormon signalering i mennesker og andre dyr, potensielt redusere fruktbarhet og økt risiko for sykdom. Til tross for betydningen av EØS og andre endokrine forstyrre kjemikalier (EDCs) for folkehelsen, er hormonforstyrrende ikke vanligvis inkludert i undergraduate læreplaner. Dette brist er delvis på grunn av mangel på relevante laboratorie aktiviteter som illustrerer prinsippene involvert samtidig være tilgjengelig for studenter. Denne artikkelen presenterer en optimalisert Ja for kvantifisere ligander i personlig pleieprodukter som binder østrogen reseptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden opptar en av de to kolorimetrisk underlag (Orto– nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) eller chlorophenol rød-β-D-galactopyranoside (CPRG)) som er kløyvde av β-galactosidase, en 6-dagers nedkjølt inkubasjon skritt lette bruk undergraduate laboratorium kurs, et automatisert program for LacZ beregninger og R koden for den tilknyttede 4-parameteren logistisk regresjonsanalysen. Protokollen er utviklet for å tillate studentene å utvikle og gjennomføre eksperimenter der de skjermen produkter av deres valg for østrogen imiterer. I prosessen lærer de om hormonforstyrrende, cellekultur, reseptor bindende, enzym aktivitet, genetisk engineering, statistikk og eksperimentell design. Samtidig, de også praksis grunnleggende og bredt aktuelt laboratorium ferdigheter, som: beregne konsentrasjoner; gjør løsninger; demonstrere steril teknikk; å fortynne serier standarder; konstruere og interpolere standard kurver; identifisere variabler og kontroller. samle, ordne og analysere data. konstruere og tolke grafer; og bruker vanlige laboratorieutstyr som micropipettors og Spektrofotometrene. Dermed oppfordrer implementere denne analysen studenter å engasjere seg i inquiry-basert læring mens å utforske aktuelle problemstillinger i miljølære og helse.
Gjær østrogen skjermen (Ja) er mye brukt å kvantifisere ligander som etterligner østradiol (E2 eller 17β-østradiol) i en rekke matriser, inkludert vann, plante vev, forbrukerprodukter og mat1,2,3, 4. Kollektivt, kalles slik ligander “Miljømessige østrogener (EØS).” Ja ble opprinnelig utviklet som en lav kostnad, i vitro alternativ til i vivo tester som gnager uterotrophic analysen5,6 og regnbueørret fôring analysen7. Målet med disse testene er å avgjøre om et produkt inneholder kjemikalier som stimulerer eller blokkerer østrogen-avhengige mekanismer. Påvisning av EØS er viktig, fordi de kan forstyrre normal endogene østrogen signalnettverk, spesielt under fosterets utvikling. Denne innblandingen kompromisser helse ved å øke risikoen for overvekt, ufruktbarhet, kreft og kognitive tap8.
Til tross for betydningen av EØS og andre EDCs for folkehelsen, er hormonforstyrrende ikke vanligvis inkludert i undergraduate læreplaner. Denne mangelen er delvis på grunn av en mangel på aktiviteter som illustrerer prinsippene involvert samtidig være tilgjengelig for studenter. I tillegg flere varianter av Ja-protokollen finnes9,10,11,12,13, og dette mangfoldet gjør analysen optimalisering tidkrevende for laboratoriet koordinatorer ikke spesielt opplært i relevante teknikker. Til slutt, ja analyser er vanligvis gjennomført over 1 lang dag eller 2 dager med en O/N inkubasjon. Denne tidsangivelsen er ikke kompatibel med formatet for undergraduate laboratorium kursene, som vanligvis møtes en gang / uke for flere h.
Svar på disse behovene rapporterer dette manuskriptet en optimalisert 96-Vel ja protokoll som inkluderer ethanolic utvinning metoder for personlig pleieprodukter (PCPs)3 og et 6-dagers kjøling skritt å imøtekomme ukentlige laboratorium møter. Absolutt etanol er et allsidig organisk løsemiddel som kan oppløse en rekke polar og forbindelser solutes. Videre er det egnet for undergraduate kurs fordi det er lett tilgjengelig, relativt nontoxic, rimelig og blandbar med vann. det fordamper også lett uten spesialutstyr. Men etanol er ikke ideelt for å trekke ut sterkt hydrofobe endokrine disruptors eller mange olje og voks, de to sistnevnte er vanlige ingredienser i PCPs. dårlig utvinning effektivitet øker risikoen for falsk negativt funn. Med denne betingelsen i tankene bør etterforskere velge utvinning prosedyrer (f.eks, ethanolic utvinning eller solid fase utvinning) som eksempel kjennetegn og møte studie mål (forskning versus undervisning undervisning).
Ja, er avhengig av rekombinant Saccharomyces cerevisiae opprinnelig opprettet av Dr. Charles Miller ved Tulane University. Se Miller et al. (2010) for kart fullstendig konstruert plasmider14. Gjær forvandlet disse plasmider constitutively uttrykke menneskelige kjernefysiske ERα eller ERβ (også kalt ESR1 og ESR2, henholdsvis) når dyrket i media som inneholder galaktose (for ERα) eller glukose eller galaktose (for ERβ). Hvis estrogenic kjemikalier finnes i media, binder de på reseptorene, opprette ligand-reseptor komplekser som aktiverer β-galactosidase (lacZ) uttrykk på et nivå som er proporsjonal med konsentrasjonen av estrogenic kjemikalier. Gjærceller er så lysed for å løslate den akkumulerte β-galactosidase. Lyseringsbuffer inneholder ONPG eller CPRG, som er kløyvde av β-galactosidase til gul eller rød produkter, henholdsvis. Kolorimetrisk produkter kan kvantifiseres ved å måle absorbansen ved hjelp av en microwell plate spektrofotometeret. Graden av fargeendring er proporsjonal med konsentrasjonen av estrogenic ligander som gjær ble utsatt.
Valget av substrat (CPRG eller ONPG) avhenger av potensialet for bakgrunnen absorbansen fremkommer fra prøvene testet. For eksempel planteekstrakter legges ofte en gul fargetone til media som utløses kunstig estrogenicity tiltak hvis ONPG (kvantifisert ved 405 nm) brukes som underlaget for β-galactosidase. Med plante ekstrakter, CPRG (kvantifisert på 574 nm) kan være et mer passende kolorimetrisk substrat. CPRG er dyrere enn ONPG, men brukes på en tiendedel av molarity. Denne artikkelen presenterer estrogenicities av PCP ekstrakter kvantifisert med både ONPG og CPRG.
Kvantifisere estrogenicity av miljøprøver med både ERα og ERβ er en mer helhetlig tilnærming enn å bruke bare én av disse reseptorene. I dyr viser disse reseptorene differensial vev distribusjon, regulatoriske aktiviteter og bindende slektskap for estrogenic og anti-estrogenic ligander15. For eksempel bind plantebaserte fytoøstrogener vanligvis ERβ mer sterkt2mens syntetiske kjemikalier kan vise preferanse for enten ERα eller ERβ eller kan binde både reseptorer like godt15. Derfor binding til en østrogenreseptor ikke nødvendigvis forutsi binding til den andre.
Selv om EØS finnes i mange forbrukerprodukter (f.eks, plantevernmidler, vaskemidler, lim, smøremidler, plast, mat og legemidler) og planter, presenteres dataene ble hentet ved hjelp av et utvalg av PCPs. PCPs er overbevisende, lett tilgjengelig rimelig og miljømessig relevant for studenter. Studenter kan bli invitert til å bringe deres favoritt PCPs hjemmefra å teste i laboratoriet. De kan også søke huden dyp databasen utviklet av Environmental Working Group16 for å generere hypotese-drevet sammenligninger av PCPs med høy og lav toksisitet score. På denne måten kan studenter samtidig utvikle avanserte laboratorium ferdigheter; delta i selvstyrt, inquiry-basert læring; og utforske aktuelle problemstillinger i miljølære og helse.
Ja er en rimelig metode som brukes til å oppdage estrogenic ligander i miljøprøver, som vann, mat, plante vev og personlig pleieprodukter. Dataene presenteres her sammenligne 2 østrogen-reseptorer (ERα og ERβ), 2 underlag (ONPG og CPRG) og 2 tidslinjer (2 d protokollen uten kjøling) og syv dagers protokollen med kjøling for å måle estrogenicity i personlig pleieprodukter via Ja analysen. 7 d, nedkjølt protokoll CPRG og gjær uttrykke ERα og/eller ERβ best kvantifiserer EEQs mens også kompatibel med tidspress pålagt av undervisning laboratorium kurs som oppfyller én gang / uke for flere h. Faktisk var sammenlignet med 2 d analysen uten kjøling, sju dagers nedkjølt analysen assosiert med redusert avvik over platen gjentak. I tillegg ble den lineære delen av standardkurve litt utvidet data samles inn med nedkjølt analysen. Den lineære delen av standardkurve definerer den analysen rekkevidden og er den eneste delen av som kan brukes til interpolere prøve EEQs.
I alle unntatt én av prøvene testet var EEQs målt ved hjelp av CPRG lavere enn kvantifisert med ONPG. Med en høyere utryddelse koeffisient og lavere Km og V-maxer CPRG ti ganger mer følsom enn ONPG17. Dermed CPRG kan brukes i lave konsentrasjoner, og kan brukes til å oppdage lavere mengder av β-galactosidase. For disse grunner er CPRG generelt foretrukket over ONPG18,19. Imidlertid forklarer større substrat følsomhet ikke lavere EEQ verdier oppdaget med CPRG. Høyere EEQ verdiene oppdaget med ONPG kan skyldes matrix interferens med analysen, som bemerket av andre forfattere2,18. Gul pigmenter fra personlig pleie produktet ekstrakter kan blåse EEQ verdier oppdaget med ONPG. Andre har omgås problemet ved å inkludere pigment kontroller i deres eksperimentell design2, en tilnærming som dobler antall plater i et eksperiment. Når matrix forstyrrelser kan være problematisk, være CPRG en å foretrekke substrat for Ja analysen, selv om det er dyrere og krever lengre inkubasjon ganger enn ONPG. Videre er fargeendring indusert av spalting av substrat av β-galactosidase mer dramatisk med CPRG, gjør det enklere for studenter å visualisere resultatene.
Miller et al. (2010), som utviklet gjæren som brukes i denne protokollen, bemerket at gjær uttrykke ERβ var 30 x mer følsomme for 17β-østradiol enn gjær uttrykke ERα, et funn som underbygges av våre data14. Bortsett fra potensielle nyansene i plasmider konstruksjon, Miller et al. (2010) kunne ikke forklare denne forskjellen i følsomhet14. Én forskjell mellom de to plasmider konstruksjoner er at ERα uttrykk er regulert av galaktose, mens ERβ uttrykk er regulert av enten glukose eller galaktose. Gjær brukes i Ja analysen er kultivert i glukose media og bare gitt galaktose når de er utvannet i starten av analysen. Derfor kan gjær uttrykke ERβ samle høyere kopi antall reseptor proteiner før starten av analysen, og dermed overdragelse høyere følsomhet estrogenic ligander.
Lavere følsomheten til ERα-uttrykke gjær kan forklare høyere priser av ikke-deteksjon av estrogenicity i prøver målt med ERα sammenlignet med ERβ. For å øke sannsynligheten for vil at prøven EEQs bli oppdaget, brukere kan benytte forskjellige utvinning løsemidler og metoder eller legge til større mengder eksempel gjær. Hvis høyere eksempel volumer, bør konsentrasjonen av E2 standarder justeres slik at det samme volumet av standarder og prøver kan bli brukt i analysen. En begrensning å legge mer prøven er at gjær tåler bare 6-10% etanol, med bedre toleranse ved inkubasjon temperaturer på 30 vs 35 ° C20. Bestemme for effekter av etanol på gjær, bør etterforskere legge til tre eksemplarer “gjær bare” brønner på den platen og bekrefte at OD610 disse “gjær bare” brønner er sammenlignbare med OD610 kjøretøy kontroll brønner umiddelbart etter tillegg av LacZ buffer. Prøver oppløst i etanol kan eventuelt legges til tørr microwell plater og etanol fordampet av før gjær er lagt. Dimethylsulfoxide (DMSO) brukes også som et eksempel løsemiddel i Ja søk, men den siste arbeider konsentrasjonen av DMSO med gjær bør være begrenset til 1%12.
Ja analysen er et kraftig screening verktøyet for å oppdage estrogenicity i miljøprøver. Spesielt oppdager Ja ligander som binder kjernefysiske østrogen-reseptorer som samhandler med østrogen respons elementene til direkte gene expression14. Ja har imidlertid også viktige begrensninger. Ja oppdager ikke EØS som fungerer gjennom ikke-nukleære mekanismer som membran østrogen reseptorer eller mekanismer som involverer flere elementer som aktivator Protein 1 (AP-1) transkripsjonsfaktorer. Videre, fordi gjær ikke har samme metabolske kapasitet som pattedyrceller, ja kan ikke oppdage ligander som krever metabolske aktivere estrogenic.
I tillegg ikke kan Ja analysen lett skille mellom estrogenic og anti-estrogenic ligander i komplekse prøver. I stedet, den måler netto estrogenicity, som er en sum av estrogenic og anti-estrogenic ligander. Å kvantifisere konsentrasjonen av ER antagonister eller vurdere hemmende aktiviteten blandinger, kan analysen endres av rugende gjær med både den standard Agonistiske (17β-østradiol) og en rekke test prøve konsentrasjoner12. Denne prosessen avgjør om antagonister i utvalgene kan minske agonist-indusert reporter aktivitet og gir en nyttig skjerm for å identifisere tilstedeværelsen av ER antagonister i prøvene.
Protokollen presenteres her rommer eksempel datatyper, selv om noen eksempler kan kreve endringer i forberedelsene utvinning og utvalg. For eksempel EEQs store variasjoner blant gjentak av noen personlig pleieprodukter. Mer variabel prøvene tendens til å inneholde olje dråper eller ellers var ikke helt homogen, indikerer at et mer lipofile løsemiddel som diethyl Eter ville være nyttig. Alternativt kan oljer og voks i personlig pleieprodukter ekskluderes ved å trekke ut prøver med 50% etanol i stedet for 100% etanol.En 50% etanol utvinning vil også ta flere vannløselige estrogenic ligander (f.eks, noen pigmenter). Men 50% etanol fordamper saktere enn 100% etanol, og dermed forlenge utvinning tid. I tillegg var eksempler (for eksempel såper) cytotoksiske til gjær, noe som resulterer i redusert celle tetthet målinger (OD610). Fox et al. (2008) foreslår at slike eksempler bør fortynnet og testes om cellen tetthet forskjeller overstige 30% i forhold til kjøretøy kontroll brønner12.
Hvis ja analysen brukes for analytisk forskningsformål, kan fortynning kurver av prøven bassenger testes for å avgjøre riktige mengder ekstrakt legges til gjær i trinn 4.5 preemptively. Alternativt ekstrakter kan testes samtidig på flere volumer (f.eks, 5 µL og 20 µL ekstrakt lagt til gjær i trinn 4.5) eller fortynninger som dekker størrelsesordener (f.eks0,2 µL, 2 µL og 20 µL). “Hensiktsmessig” mengder ekstrakt er de som identifiserer estrogenicity ved å sammenligne LacZ verdier langs den lineære delen av standardkurven. Optimalisering forhindrer problemer forårsaket ved å legge for mye eller for lite utvalg gjær, som cytotoksisitet, feilaktige negativer eller estrogenicity som overskrider standardkurven. Som nevnt ovenfor, bør volum av prøver og E2 standarder justeres når ulike mengder ligand brukes slik at gjær er utsatt for en konsistent volum og konsentrasjon av etanol eller andre kjøretøy over platen.
Til tross for potensialet for feilaktige negativer, har ja analysen blitt identifisert som en Tier 3 testverktøy for endokrine disruptors av Schug et al. (2013), som utviklet en omfattende lagdelt protokoll for endokrine forstyrrelser (TiPED)21. For undergraduate utdanning er analysen verdifulle for undervisning begreper knyttet til hormonforstyrrende, cellekultur, reseptor bindende, enzym aktivitet, genetisk engineering, statistikk og eksperimentell design. Studenter som bruker analysen også praksis grunnleggende og bredt aktuelt laboratorium ferdigheter som å fortynne serier standarder; utdrager prøver; gjør løsninger; konstruere og interpolere standard kurver; beregne konsentrasjoner; gjør løsninger; demonstrere steril teknikk; dyrking celler. identifisere variabler og kontroller. samle, ordne og analysere data. konstruere og tolke grafer; og bruker vanlige laboratorieutstyr som micropipettors og Spektrofotometrene.
The authors have nothing to disclose.
Prosjektet ble finansiert av oppstart finansiering TME og AMR fra Louisiana Tech University og Furman University, henholdsvis. Ekstra midler ble gitt av 2015 fakultetet utvikling stipend AMR og TME fra The forbundet høgskoler i Sør, Louisiana EPSCoR Pfund stipend til TME fra National Science Foundation og Louisiana styret i Regents, og en reise prisen til TME fra den Universitetet i Sør. Vi takker Dr. David Eubanks (Furman) for hjelp med statistiske analyser og Mr. Christopher Moore for “gi oss en hånd” under filmingen.
Equipment | |||
Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets. |
P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl. |
Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Supplies | |||
Sterile 15-ml conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
100 ml glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
250 ml glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
10 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
1 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast | |||
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 – 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |