Real-time iontophorese med tetramethylammonium til kvantificering af volumen fraktion og tortuosity af hjernens ekstracellulære rum

Summary

Denne protokol beskriver realtids-iontoforese, en metode, som måler fysiske parametre for hjernens ekstracellulære rum (ECS). Diffusionen af ​​et inert molekyle, der frigives i ECS, anvendes til at beregne ECS-volumenfraktionen og tortuositeten. Det er ideelt til at studere akut reversible ændringer i hjernens ECS.

Abstract

Denne gennemgang beskriver de grundlæggende begreber og protokollen til at udføre realtids-iontoforese-metoden (GTI), guldstandarden til at udforske og kvantificere det ekstracellulære rum (ECS) i den levende hjerne. ECS omgiver alle hjerneceller og indeholder både interstitiel væske og ekstracellulær matrix. Transporten af ​​mange stoffer, der kræves til hjernens aktivitet, herunder neurotransmittere, hormoner og næringsstoffer, sker ved diffusion gennem ECS. Ændringer i volumen og geometri i dette rum forekommer under normale hjerneprocesser, som søvn og patologiske tilstande, som iskæmi. Men strukturen og reguleringen af ​​hjerne ECS, især i syge stater, forbliver stort set uudforsket. RTI-metoden måler to fysiske parametre af levende hjerne: volumenfraktion og tortuositet. Volumenfraktion er andelen af ​​vævsvolumen optaget af ECS. Tortuosity er et mål for den relative hindring, et stof møder, når det diffunderer gennem en hjerne reGion i forhold til et medium uden forhindringer. I RTI pulses et inert molekyle fra en kilde-mikroelektrode til hjernens ECS. Da molekyler diffunderer væk fra denne kilde, måles den ændrede koncentration af ionet over tid ved anvendelse af en ion-selektiv mikroelektrode placeret omtrent 100 μm væk. Fra den resulterende diffusionskurve kan både volumenfraktion og tortuositet beregnes. Denne teknik er blevet brugt i hjerneskiver fra flere arter (herunder mennesker) og in vivo for at studere akutte og kroniske ændringer i ECS. I modsætning til andre metoder kan RTI bruges til at undersøge både reversible og irreversible ændringer i hjernens ECS i realtid.

Introduction

Det ekstracellulære rum (ECS) er netværket af indbyrdes forbundne kanaler udvendigt til alle hjerneceller og indeholder både interstitiell væske og ekstracellulær matrix ( figur 1a og figur 1b ). Fordelingen af ​​mange stoffer, der kræves til hjernecellens funktion, herunder næringsstoffer, hormoner og neurotransmittere, forekommer ved diffusion gennem ECS. Ændringer i de fysiske parametre i dette rum, herunder volumen, geometri og ekstracellulær matrix, kan drastisk påvirke diffusion gennem ECS og de lokale ionkoncentrationer, badinghjerneceller, som har en dybtgående indvirkning på hjernecellens funktion ^{1 , 2} .

Real-time iontoforese (RTI) bruges til at bestemme to strukturelle egenskaber i en hjerneområde: volumenfraktion og tortuosity ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. Volumenfraktion ( α ) er andelen af ​​vævsvolumen optaget af ECS ( V _ECS ) i forhold til det totale vævsvolumen ( V _væv ) i et repræsentativt elementært volumen;

Tortuosity ( λ ) er den relative hindring, som et stof møder, når det diffunderer gennem en hjernegruppe sammenlignet med et medium uden forhindringer;

Hvor D ^* (cm ² s ^-1 ) er den effektive diffusionskoefficient af stoffet i hjerne og D (cm ² s ^-1 ) er stoffets fri diffusionskoefficient i et frit medium, såsom fortyndet agarosegel.

I dag er det mest anvendte probesubstans for RTI-metoden er det lille kationtetramethylammonium (TMA). TMA har en molekylvægt på 74 g / mol, dissocieres fuldstændigt i opløsning og har en positiv ladning. RTI undersøgelser med denne ion har vist at α 0,2 og λ 1,6 ^{1 , 2} . Det betyder, at ECS er ca. 20% af det samlede hjernevolumen, og at diffusionen af ​​et lille inert molekyle forekommer ca. 2,5 gange langsommere i ECS end i et medium uden forhindringer ³ . Imidlertid varierer både a og λ med hjernens alder, region og tilstand og i patologiske forhold ¹ . Ændringer af disse parametre har været forbundet med hjernens udvikling, aldring, søvn, epilepsi og mange andre grundlæggende processer og hjernens sygdomme ^{1, 6} . Mens andre teknikker måler α og λ , kan RTI måle både i lokaliserede områder af levende væv i realtid. Af denne grund er RTI blevet et uundværligt redskab til at undersøge ændringer i α og λ under akutte og reversible udfordringer.

Teorien til støtte for RTI blev oprindeligt valideret af Nicholson og Phillips, og teknikken er blevet brugt udbredt siden dengang ^{4 , 7} . Eksperimenter, der anvender RTI, begynder med frigivelsen af ​​en puls af TMA fra en kilde-mikroelektrode ved iontoforese i en fortyndet agarosegel. Når de er udkastet, diffunderer ionerne frit fra punktkilden og vælger fra et potentielt uendeligt antal tilfældige stier ( figur 1d ). Den ændrede koncentration af ionen måles over tid ved anvendelse af en ion-selektiv mikroelektrode (ISM) placeret groft100 μm væk ( figur 1c ). Ændringerne i TMA-koncentrationen er graferet og monteret på en kurve, der gør det muligt at beregne både D og transportnummeret for iontofores mikroelektroden (parametre diskuteret i protokollen). Med disse værdier gentages proceduren i en hjerneområde af interesse for at opnå D ^* og at beregne både α og λ . Kontrol af iontofores mikroelektroden, dataindsamling, grafing og montering af TMA-koncentrationskurven og beregning af eksperimentelle parametre udføres typisk af programmerne Wanda og Walter, som er specielt designet til dette formål (softwaren og deres manualer er Frit tilgængelig fra forfatterne efter anmodning).

Protokollafsnittet i denne gennemgang beskriver de grundlæggende procedurer, der er nødvendige for at designe og udføre RTI i hjerneskiver af gnavere. Teknikken er også blevet brugt i ikke-stangEnt modeller, herunder humane hjerne skiver og di vivo hjernen præparater ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . Afsnittet Repræsentative resultater giver både ideelle og ikke-ideelle resultater for at fremhæve nuancer i datatolkning. Endelig dækker diskussionsafsnittet kortfattet fejlfindingsteknikker, begrænsninger af RTI, alternative teknikker, der bruges til at studere ECS, og fremtidige anvendelser af RTI.

Figur 1: Diagrammer af diffusion gennem ECS. ( A ) Diagram over ECS: Viser størrelsen og placeringen af ​​ECS i en typisk hjerneafdeling. Gul markerer ECS mellem de grå hjernecelleprocesser. Volumenet af ECS er ca. 20% af den samlede vævsvolumen ( dvs. volumenfraktion = 0.2) under fysiologiske forhold. ( B ) Forstørret diagram af ECS: Fremhæver fysiske parametre, der bidrager til tortuositet, herunder hjernecellegeometri (grå) og ekstracellulær matrix (skitseret som et maske af flerfarvede glycosaminoglycaner og proteoglycaner). ( C ) 3D-diagram over diffusion fra en punktkilde: demonstrerer netbevægelsen af ​​inerte molekyler fra en iontoforetisk kilde til en ISM. Udelukkende diffusionsbarrierer og cellulær optagelse diffunde molekyler udad i alle retninger og producerer en sfærisk koncentrationsfront. ISM kvantificerer den lokale koncentration af de inerte molekyler frigivet fra den iontoforetiske kilde. ( D ) Computer simulering af diffusion i hjerne ECS: [langt til venstre] Setup for Monte Carlo simulering; Grønne kugler repræsenterer hjernecelleprocesser, og det røde kors repræsenterer en punktkilde. Denne opsætning modellerer hjernevævet diagrammet i figur 1a . [Mellembilleder] 3 og6 molekyler udfører tilfældige bevægelser, da de diffunderer gennem hjernens ekstracellulære rum, vist i 2 dimensioner. [Langt til højre] Tilfældige vandringer af mange molekyler frigivet fra punktkilden. Netto bevægelsen af ​​alle molekyler fra punktkilden er udad som vist i figur 1c . De kumulative tilfældige gåture skitserer mellemrummene mellem cellerne ( dvs. ECS, se reference ⁵ for yderligere forklaring). Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Alle dyreprocedurer, der bruges til at opnå vævsprøver, blev godkendt af dyreetikudvalget ved SUNY Downstate Medical Center. 1. Fremstilling af løsninger og udstyr Forbered en 150 mM NaCl-påfyldningsopløsning til ISM's referencebeholder. Opbevares i en 10 ml sprøjte, der er fastgjort til et 0,22 μm filter (for at fjerne bakterier eller partikler). Forbered en 150 mM TMA chlorid (TMA-Cl) -fyldningsopløsning for mikroelektroderne. Opbevares i en 10 ml sprøjte…

Representative Results

Anvendelsen af ​​RTI-teknikken er demonstreret i et eksperiment designet til at måle ændringerne i a og under en hypoosmolær udfordring ( figur 8 og figur 9 ). Det har tidligere vist sig, at reduktion af osmolariteten af ​​ECS ved vask på hypotonisk ACSF vil medføre et fald i α og en stigning i λ 13 . I…

Discussion

Figur 10: Ikke-ideelle data, der viser almindelige tekniske problemer. ( A ) Diagrammer af fælles tekniske problemer med iontofores mikroelektroder: Sammenligning af den normale frigivelse af TMA fra en fungerende iontofores mikroelektrode med tre kilder, der viser tekniske problemer. [Høj forstørrelse, a1] Strømmen i en ideel iontoforetisk kilde bæres lige ved TMA frigivelse og chloridoptagels…

Materials

A/D and D/A converter	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM	Dagan	Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier	ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective)			for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing	Harvard Apparatus	Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811	double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush	Winsor & Newton	University Series 233, size 0	round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner	Fisher
camera for visualizing micropipettes	Olympus	OLY-150	requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder			to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99%	Sigma-Aldrich	catalog # 92360	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software	The MathWorks	MATLAB, Data acquisition toolbox	for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles	Fisher
fixed-stage compound microscope	Olympus	BX51WI	can use other compound microscopes with fixed stages
forceps	Fine Science Tools	#11251-10	to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide	Fisher	#12-550A	to chip microelectrode tips
heater/stirrer	Fisher	Corning PC-420D	to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit	Dagan	ION-100 and PS-100	ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium	World Precision Instruments	IE190 Potassium Ion Exchanger	Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate – do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder	WPI	M3301EH	to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator	Narishige	MM-3	to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97	to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer	Physiotemp	Model BAT-12R	fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle	BD	Syringes and Needles # 305122 (25 gauge)	for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm)
objective 5x dry	Olympus	MPlan N
objective 10x water immersion	Olympus	UMPlan FL N	10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids)	Fisher	#14-375-148	to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope	EXFO	Gibraltar Burleigh	platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup			for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive	Bostik	Blu-Tack	for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning	Sutter Instruments	MP-285	two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter	Axon Instruments	CyberAmp 320 or 380	no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire	A-M Systems	#7830	diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber	Harvard Apparatus	Warner Model RC-27L	this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL	BD	Syringes and Needles #309604	to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22µm pore	Whatman	#6780-1302	to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing	Component Supply	STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge)	for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B and SH-27A	TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome	Leica	VT1000S	to cut brain slices
xylenes	Fisher	X5-1	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description