Techniques de laboratoire utilisées pour maintenir et différencier les biotypes de<em> Vibrio cholerae</em> Isolats cliniques et environnementaux
Summary
Ce manuscrit décrit les bonnes techniques de maintenance de Vibrio cholerae en plus d'une série de tests biochimiques, utilisés collectivement pour une différenciation rapide et fiable entre V clinique et environnementale. Biotypes de cholérae en laboratoire.
Abstract
La bactérie aquale Gram négatif Vibrio cholerae est l'agent étiologique de la maladie gastro-intestinale infectieuse choléra. En raison de la prévalence et de la gravité mondiales de cette maladie, V. Cholerae a été largement étudié à la fois dans les environnements environnementaux et de laboratoire, nécessitant des techniques de maintenance et de culture appropriées. Classique et El Tor sont deux biotypes principaux qui composent le V. Le sérogroupe de cholerae O1, présentant chacun des caractéristiques génotypiques et phénotypiques uniques qui fournissent des mécanismes fiables pour la caractérisation du biotype et nécessitent des conditions de culture induisant une virulence distincte. Indépendamment du biotype de la souche causale pour une infection ou une flambée donnée, le traitement standard pour la maladie implique une thérapie de réhydratation complétée par un régime d'antibiotiques. Cependant, la classification des biotypes peut être nécessaire pour les études de laboratoire et peut avoir des impacts plus larges dans le domaine biomédical.Au début des années 2000, des isolats cliniques ont été identifiés et présentent des caractéristiques génotypiques et phénotypiques à la fois des biotypes classiques et El Tor. Les hybrides nouvellement identifiés, appelés les variantes El Tor, ont fait que l'identification des biotypes isolés cliniques et environnementaux devient plus complexe que les protocoles d'identification traditionnels précédents. En plus de décrire V. Cholerae, maintenance générale et techniques de culture, ce manuscrit décrit une série d'écrans génétiques et de tests phénotypiques spécifiques à la gène ( ctxB et tcpA ) (résistance au polymyxine B, métabolisme du citrate, activité protéolytique, activité hémolytique, motilité et métabolisme du glucose via Voges- Analyse Proskauer) utilisé collectivement pour caractériser et / ou distinguer les biotypes classiques et El Tor. Ensemble, ces tests fournissent une approche systématique efficace pour être utilisée comme alternative, ou en plus, à des expériences coûteuses et à forte intensité de main-d'œuvre dans la caractérisationTion de V. Isolats cliniques (et environnementaux) de cholerae .
Introduction
Le choléra est une maladie de l'intestin grêle distal causée par la consommation d'aliments contaminés ou d'eau contenant la bactérie Gram-négative Vibrio cholerae aquatique. Les symptômes du choléra incluent les vomissements et la diarrhée aqueuse incontrôlable, entraînant une déshydratation sévère qui, si elle n'est pas traitée correctement, entraînera la mort. V. Cholerae peut être divisé en plus de 200 sérogroupes basés sur la structure de l'antigène O de lipopolysaccharide de surface cellulaire. Cependant, seuls 2 sérogroupes, O1 et O139 ont montré un potentiel d'épidémie ou de pandémie 1 , 2 . En outre, le sérogroupe O139 a été principalement isolé dans le sud-est de l'Asie 3 , 4 , tandis que le sérogroupe O1 est distribué dans le monde entier. En outre, le sérogroupe O1 peut être divisé en 2 biotypes principaux: classique et El Tor. Le biotype classique était responsable de la première 6 pandémie de choléraS entre 1817 et 1923. La septième pandémie actuelle est le résultat du biotype El Tor, qui a déplacé globalement le biotype classique dans l'environnement 5 , 6 , 7 . Récemment, des souches ont eu des caractéristiques distinctives des biotypes classiques et El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 et ont été appelées variantes El Tor 13 , 17 . Certaines variantes d'El Tor ont démontré des capacités de virulence élevées avec une progression de la maladie plus rapide et plus sévère que celles observées précédemment, soulignantLa nécessité d'une approche plus complète de l'identification des agents et de la prévention et du traitement des maladies 8 , 9 , 18 . Bien que l'identification des biotypes ne dicte pas immédiatement le traitement, d'autres progrès dans le développement du vaccin et les futurs agents thérapeutiques peuvent bénéficier de la distinction du biotype.
La première série de protocoles répertoriés ici permettra aux enquêteurs de maintenir correctement V. Cholerae dans un milieu de laboratoire. La cohérence et l'analyse ultérieure nécessitent la préparation des stocks et la croissance des isolats, qui ne dépend pas du biotype. Cependant, pour induire de manière optimale l'expression du gène de la virulence, des techniques indépendantes de culture de biootype sont nécessaires 19 . En outre, la préparation de divers essais génétiques et biochimiques est présentée dans ce manuscrit.
La toxine du choléra (CT) et la toxine co-rePilus goudronné (TCP) sont deux principaux facteurs de virulence contrôlés par le régulateur principal ToxT dans les deux biotypes du V. Cholerae O1 serogroup 20 . CT est une toxine bipartite composée de cinq CtxB Sous-unités entourant une seule sous-unité CtxA, et est responsable de la perte rapide d'électrolyte associée au choléra. TCP est un pilus de type IV codé par l'opéron tcp ( tcpABQCRDSTEF ) et implique l'attachement et la colonisation de l'intestin grêle distal. TcpA est le premier gène de l'opéron tcp qui code les sous-unités individuelles de piline essentielles à la construction du pilus 8 . La séquence génétique pour ctxA est complètement conservée entre les biotypes classiques et El Tor, tandis que ctxB et tcpA diffèrent selon les deux biotypes mais sont conservés au sein de chaque biotype 8 . CtxB est complètement conservé entre les biotypes sauf à deux positions de baseTions (115 et 203). Dans le biotype El Tor, la thymine réside aux positions de base 115 et 203, tandis que le biotype classique contient de la cytosine à ces bases. TcpA est complètement conservé au sein de chaque biotype, mais diffère à plusieurs bases entre les biotypes. Ces distinctions génétiques servent de marqueurs d'identification de biotype primaires et, après séquençage du produit d'amplification de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), y compris ces sites, les séquences isolées peuvent être comparées aux O395 ou WT El Tor N16961 de type sauvage (WT) pour déterminer l'arrière-plan du biotype De CT et TCP, respectivement, dans un isolât donné V. cholerae .
De nombreux protocoles ont été développés pour caractériser les distinctions phénotypiques entre les biotypes classiques et El Tor 21 , 22 , 23 . La polymyxine B est un antibiotique peptidique qui compromet l'intégrité de la membrane cellulaire externe dans un bac Gram négatifEt la résistance à la polymyxine B peuvent être visualisées à travers le test de résistance à la polymyxine B 21 . La citrate est un substrat primaire du cycle du Kreb et la capacité de métaboliser le citrate comme seule source de carbone peut être déterminée en utilisant le dosage du métabolisme citrate 22 . HapR code un régulateur global et le régulateur de détection de quorum maître dans V. cholerae, HapR, qui se lie à différentes régions de promoteur et régule l'expression de gène et d'opéron 24 . Certaines souches pathogènes de V. cholerae ont une mutation de changement de cadre naturelle dans le gène hapR qui a causé la perte de cette régulation dépendante de la densité de l'expression du gène de la virulence 24 , 25 . La mesure de l'activité de protease régulée par HapR en utilisant des milieux de gélose au lait permet au chercheur d'identifier si un isolât particulier contient un HapR 23 fonctionnel. leTests de dosage de l'hémolyse pour la capacité d'une souche à sécréter des enzymes hémolytiques qui lyse les globules rouges; Le degré d'hémolyse peut être visualisé sur les plaques d'agar sanguin 23 . La motilité est souvent associée à la virulence chez V. cholerae et peut être analysée à l'aide de plaques d'agarine de motilité 23 . Le test Voges-Proskauer teste la capacité d'une souche à fermenter le glucose en tant que seule source de carbone et produit le sous-produit acétoïne 21 . Avec l'émergence de variantes d'El Tor, il est difficile de prédire les résultats d'un dosage phénotypique donné sans dépistage génotypique étendu et avant de déduire le fond de biotype de V. Cholerae, il est recommandé d'effectuer cet assemblage des dosages 23 et de comparer les résultats aux souches de référence comme dans le tableau 2 .
Dans ce cas, nous avons avancé une série de protocoles, en utilisant collectivement ce qui précèdeDes tests génotypiques et phénotypiques pour une approche plus globale pour caractériser V. Biotypes de choléra. De plus, nous avons décrit les distinctions génotypiques et phénotypiques des V connus. Cholerae El Tor variantes (MQ1795 et BAA-2163), par rapport aux souches de référence de biotype couramment utilisées (WT classique O395, WT El Tor C6706 et WT El Tor N16961, tableau 1 ). L'émergence de variantes d'El Tor a présenté des défis à la fiabilité des protocoles de caractérisation de biotype à dosage unique précédemment employés; Cependant, ce système d'identification par dosage multiple permettra une caractérisation plus sûre des V cliniques et environnementales. Isolats de cholerae .
Protocol
Representative Results
Discussion
Parmi les plus de 200 V identifiés. Sérogroupes de cholerae , seuls O1 et O139 ont un potentiel épidémique. Le sérogroupe O1 peut être divisé en deux biotypes: classique et El Tor. Cependant, des souches hybrides, appelées les variantes 13 , 17 d' El Tor, ont émergé et possèdent les antécédents de biotype El Tor, et portent les caractéristiques classiques 8 , 9 ,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche soutenue par New Hampshire-INBRE grâce à un Prix de développement institutionnel (IDeA), P20GM103506, de l'Institut national des sciences médicales générales du NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
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| Blood Agar Plates | Remel | R01200 | Store at 4 °C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
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| GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
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| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
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| NaNH4HPO4·4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
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| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
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| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
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