バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術<em>コレラ（Vibrio cholerae）</em>臨床分離株
Summary
この原稿は、一連の生化学的アッセイに加えて、適切なビブリオコレラ（Vibrio cholerae）の維持技術を説明し、臨床的および環境的V間の迅速かつ確実な区別のために集合的に利用される。 コレラバイオタイプは実験室環境で使用されます。
Abstract
水生グラム陰性菌であるビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）は、感染性胃腸疾患コレラの病原体である。この病気の世界的な有病率および重症度のために、 V 。 コレラは環境および実験室の環境の両方で広範に研究されており、適切な維持および培養技術が必要である。古典とエルトールは、 Vを構成する2つの主要なバイオタイプです。 コレラ菌 O1血清群であり、それぞれがバイオタイプの特徴付けのための信頼性のある機構を提供するユニークな遺伝子型および表現型特性を示し、培養条件を誘導する特異的ビルレンスを必要とする。所与の感染またはアウトブレイクの原因となる菌株のバイオタイプに関わらず、この疾患の標準的な治療には、抗生物質のレジメンを補充した再水和療法が含まれる。しかしながら、バイオタイプの分類は、実験室研究に必要であり、生物医学分野においてより広い影響を及ぼす可能性がある。2000年代初期には、古典的およびEl Torバイオタイプの両方からの遺伝子型および表現型形質を示す臨床分離株が同定された。 El Tor変異体と呼ばれる新しく同定されたハイブリッドは、従来の伝統的な単一アッセイ同定プロトコールよりも臨床的および環境的な分離生物型同定をより複雑にしている。 Vを記述することに加えて。 （ ctxBおよびtcpA ）PCRベースの遺伝子スクリーニングおよび表現型アッセイ（ポリミキシンB耐性、クエン酸代謝、タンパク質分解活性、溶血活性、運動性、およびグルコース代謝）を、Voges- Proskauerアッセイ）は、古典的なタイプとEl Torのバイオタイプを特徴付けるおよび/または区別するために集合的に使用された。一緒に、これらのアッセイは、代用品として、または加えて、特徴的な費用のかかる労働集約的実験に使用される効率的な体系的アプローチを提供するVの コレラ（臨床的および環境的）分離株。
Introduction
コレラ（Cholera）は、水生グラム陰性細菌であるコレラ菌（Vibrio cholerae）を含む汚染された食物または水の消費によって引き起こされる遠位小腸の病気である。 コレラの症状には、吐き気や制御不能な水様の下痢があり、重度の脱水症状につながり、適切に治療しなければ死に至る。 V。 コレラは、細胞表面リポ多糖O-抗原の構造に基づいて200を超える血清群に分けることができる。しかし、O1とO139の2つの血清群のみが、流行またはパンデミックの可能性1,2を示している。さらに、血清群O139は、主に東南アジア3、4に単離され、血清群O1は世界中に分布している。さらに、O1血清群は、2つの主なバイオタイプに分類することができる：クラシックおよびエル・トール。古典的なバイオタイプは、最初の6つのコレラパンデミック進行中の第七のパンデミックは、環境の古典的バイオタイプを世界的に置き換えたEl Torバイオタイプの結果である5,6,7 。最近、古典的およびエルトールバイオタイプ8,9,10,11,12,13,14,15,16,17の両方の顕著な特徴を含む株が生じており、以来、El Torバリアント13,17と呼ばれている。一部のEl Tor変異体は、以前に観察されたものよりも迅速かつ重度の疾患進行を伴って病原性能力の上昇を示しており、代理人の特定と疾病の予防と治療に対するより包括的なアプローチの必要性8,9,18。バイオタイプの同定は治療を即座に指示しないが、ワクチン開発および将来の治療剤のさらなる進歩は、バイオタイプの区別の恩恵を受ける可能性がある。
ここに記載された最初の一連のプロトコルは、研究者がVを適切に維持することを可能にする。実験室環境でのコレラ菌株。一貫性およびその後の分析には、バイオタイプに依存しない分離物のストック調製および増殖が必要である。しかし、病原性遺伝子発現を最適に誘導するためには、独立した生物型特異的培養技術が必要とされる19 。さらに、様々な遺伝的および生化学的アッセイのための準備がこの原稿に概説されている。
コレラトキシン（CT）と毒素が共存する（ V）の両方のバイオタイプにおいて、マスターレギュレーターToxTによって制御される2つの主要なビルレンス因子である。 コレラ O1血清群20 。 CTは、5つのCtxB 単一のCtxAサブユニットを取り囲むサブユニットであり、コレラに伴う急速な電解質損失を引き起こす。 TCPは、 tcpオペロン（ tcpABQCRDSTEF ）によってコードされるIV型線毛であり、遠位小腸の付着およびコロニー形成に関与する。 tcpAは、線毛8の構築に必須の個々のピリンサブユニットをコードするtcpオペロンの最初の遺伝子である。 ctxAの遺伝子配列は、古典型とEl Torのバイオタイプの間で完全に保存されていますが、 ctxBとtcpAは2つのバイオタイプで異なりますが、各バイオタイプ8内で保存されています。 ctxBは、2塩基posi以外のバイオタイプ間で完全に保存されている（115と203）。 El Torバイオタイプでは、チミンは塩基番号115および203に存在し、古典的なバイオタイプはこれらの塩基にシトシンを含む。 tcpAは、各バイオタイプ内で完全に保存されているが、バイオタイプ間の複数の塩基で異なる。これらの遺伝子の区別は、一次バイオタイプ同定マーカーとして役立ち、これらの部位を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅産物の配列決定後、野生型（WT）古典的O395またはWT El Tor N16961と比較して、 CTおよびTCPの、それぞれ、 V. cholerae分離株における。
古典的およびEl Torバイオタイプ21,22,23の間の表現型の特徴を特徴付けるために、多数のプロトコルが開発されている。ポリミキシンBは、グラム陰性菌の外細胞膜の完全性を危うくするペプチド抗生物質であるテリアおよびポリミキシンB耐性は、ポリミキシンB耐性アッセイ21を介して視覚化することができる。クエン酸塩はクレブスサイクルの主要な基質であり、唯一の炭素源としてクエン酸塩を代謝する能力は、クエン酸代謝アッセイ22を用いて決定することができる。 hapR は、様々なプロモーター領域に結合し、遺伝子およびオペロンの発現を調節する、 V. cholerae、 HapRのグローバルレギュレーターおよびマスタークオラムセンシングレギュレーターをコードする24 。 V. choleraeのいくつかの病原性株は、 病原性遺伝子発現のこの密度依存的調節を失わせたhapR遺伝子に天然に存在するフレームシフト突然変異を有する24,25 。乳寒天培地を用いてHapR調節プロテアーゼ活性を測定することにより、研究者は、特定の単離物が機能的HapR 23を含むかどうかを同定することができる。ザ赤血球を溶解する溶血酵素を分泌する株の能力についての溶血アッセイ試験;血液寒天プレート23上に溶血の程度を視覚化することができる。運動性はしばしばコレラ菌の病原性に関連し、運動性寒天プレート23を用いて分析することができる。 Voges-Proskauerアッセイは、唯一の炭素源としてグルコースを発酵させ、副産物アセトイン21を産生する株の能力を試験する。 El Tor変異体の出現により、広範な遺伝子型スクリーニングなしに、およびVのバイオタイプバックグラウンドを推定する前に、任意の表現型アッセイの結果を予測することは困難である。 コレラ菌単離物の場合、アッセイ23のこのアセンブリを実施し、その結果を表2のような参照株と比較することが推奨される。
ここでは、一連のプロトコルを進めており、これらのプロトコルをまとめて使用していますVを特徴付けるためのより包括的なアプローチのための遺伝子型および表現型アッセイを提供する。 コレラバイオタイプ。さらに、我々は既知のVの遺伝子型と表現型の区別を述べた。 （WT古典的なO395、WT El Tor C6706、およびWT El Tor N16961; 表1 ）と比較して、コレラエルEl Tor変異体（MQ1795およびBAA-2163）を使用した。 El Tor変異体の出現は、以前に採用された単一アッセイバイオタイプの特徴付けプロトコルの信頼性に対する課題を提示した。しかしながら、この複数のアッセイ同定システムは、臨床的および環境的Vのより信頼性の高い特徴付けを可能にする。 コレラ分離株。
Protocol
Representative Results
Discussion
200以上の識別されたVのうち、 コレラ血清型、O1およびO139のみが流行の可能性がある。 O1血清群は、古典的およびエル・トールという2つのバイオタイプに分類することができる。しかしながら、El Tor変異体13,17と呼ばれるハイブリッド株は、El Torバイオタイプの背景を有し、古典的な特徴8,9,10,11,12,13,14,15,16,17を有する。この原稿に記載されているプロトコルは?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
New Hampshire-INBREの支援を受け、NIHの全米医科学研究所の施設開発賞（IDeA）、P20GM103506によって支援されました。
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
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| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
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| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit | New England Biolabs | N0446S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
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| DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
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| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
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| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
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| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
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| Taq Reaction Buffer | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
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| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
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