מדידת צפיפות של משקפיים מימיים בטמפרטורות קריוגניות
Summary
פרוטוקול לקביעת צפיפות השלב הזגוגי של טיפות בגודל של מיקרו-פיקו-ליטר מתוארות בטמפרטורות קריוגניות.
Abstract
אנו מדגימים שיטה לקביעת צפיפות טמפרטורה קריוגנית שלב זגוגי של תערובות מימיות, ודגימות אחרות הדורשות קירור מהיר, כדי להכין את השלב הרצוי טמפרטורה קריוגני. Microliter כדי טיפות בגודל picoliter הם מקורר על ידי הקרנה לתוך תערובת חנקן נוזלי (N 2- AR) תערובת. השלב הטמפרטורה הקריוגני של הירידה מוערכת באמצעות assay חזותי כי בקורלציה עם מדידות עקיפה X- קרן. הצפיפות של N 2 נוזל תערובת נוזלי מותאם על ידי הוספת N 2 או Ar עד ירידה הופך נייטרלי ציפה. הצפיפות של תערובת זו ולכן של ירידה נקבע באמצעות מסה הבדיקה עקרון ארכימדס. עם טיפול הולם בהכנה טיפה, ניהול של גז מעל תערובת קריוגן נוזלי כדי למזער את הדובדבן, ערבוב קבוע של תערובת cryogenic כדי למנוע ריבוד צפיפות הפרדת פאזה, צפיפות מדויקת עד 0.5% של טיפות קטנה כמו 50 pL יכולייקבע בקלות. מדידות על תערובות cryoprotectant מימית לספק תובנה לפעולה cryoprotectant, ולספק נתונים כמותיים כדי להקל על ההתאמה תרמית תרמית ב cryopreservation ביולוגי.
Introduction
המאפיינים הפיזיים של מים ותערובות מימיות בשלבים השונים שלהם הם בעלי עניין בסיסי, והם חשובים ב vivo ובבדיקות הבנה של מערכות ביולוגיות. ב cryobiology עכשווי cryopreservation ביולוגי, שלבי זגוגי או אמורפי של תערובות cryoprotectant מימיים הם בעלי עניין מיוחד 1 , 2 . נוקלאציה וצמיחה של גבישי קרח יכולים לשבש תאים ורקמות, ולקדם denaturation חלבון צבירה, כך פרוטוקולים cryopreservation כי מזין את הממס הפכו פופולריים יותר ויותר. ב קריסטלוגרפיה biomolecular, התגבשות של ממס בערוצים בין biomolecules משבש סריגים קריסטל ו degrades תכונות עקיפה. ויטריפיקציה מושגת באמצעות שילוב של קירור מהיר, התייבשות, וכן הוספת ממיסים cryoprotective כגון גליצרול, אתילן גליקול, פוליאתילן גליקולים (PEGs)אלכוהולים ומלחים.
ויטריפיקציה מגבילה את התגבשות הקרח וצמיחתו, אך אינה מבטלת את כל הנזק המדוייק הקשור לקירור. לדוגמה, פסיפס קריסטל (מדד של התפלגות האוריינטציות של המטוס הבדולח) עולה באופן שגרתי על ידי גורם של 10 עד 100 כאשר גבישי חלבון מתקררים למצב מבושל 3 , ושיעורי ההישרדות שלאחר ההפשרה של תאי זרע וביציות מזוקקים משתנים במידה רבה .
מנגנון נזק אחד הוא התכווצות דיפרנציאלית של חומר ממס וסובב במהלך קירור 3 , 4 , 5 . שיווי המשקל ריכוזי ממס ממסרים בתוך גביש, תא או רקמות הם תלויים הטמפרטורה, ואת ממס בתוספת המומס ואת החומר שמסביב יכול חוזה בחוזים שונים. הקירור המהיר עשוי למנוע החלוקה מחדש של הממס והחלץ לפני הזיקוק, וקבלנים שונים על עלול לגרום גדול, unhomogenous, nonequilibrium מדגיש לגרום נזק מדגם.
גישות רציונליות להקטנת הנזק הנגרם על ידי קירור יכולות, לפיכך, להפיק תועלת מהידע על צפיפות תלויה בטמפרטורה של תערובות מימיות נוזלות ומזוהמות. ב ריכוזי מומס מעל 50% משקל של מומס למשקל של פתרון (w / w), תערובות cryoprotectant מימית ביותר יכול להיות מבושל עם שיעורי קירור צנוע של 10 K / s או פחות, המאפשר ייצור של מדידות צפיפות באמצעות דגימות זגוגית גדולה 6 . צפיפות אז ניתן לקבוע באמצעות עקרון ארכימדס, על ידי מדידת המשקל הנראה של המדגם כאשר מושעה קריוגן נוזלי כמו חנקן. עם זאת, כמו ירידה ריכוזיות סולידית, שיעורי הקירור הדרושים זיקוק לגדול במהירות: שיעורי קירור של תערובות גליצרול מימיים עולה מ <10 K / s ב 50% משקל של מומס ב G כדי נפח הפתרון מ"ל (w / v) ל 1,000 K / s ב 25% w / vהתחת = "xref"> 7. העברת חום הופך גבול הגבול שכבת מוגבלת, כך השגת שיעורי קירור גדול דורש דוגמאות קטנות וקטנות יותר 8 .
מדידות הצפיפות של מים זגוגיים טהורים וקרח הושגו על ידי הפקדת טיפות קוטר מיקרומטר (femtoliter נפח) טיפות בתוך ואקום על גבי קירור cryogenically השטח כדי לבנות מדגם macroscopic (מסה גרם). הצפיפות של מדגם זה נקבעה על ידי cryoflotation בתערובת חנקן נוזלי ארגון, שבו צפיפות של נוזל cryogenic היה מותאם עד המדגם הפך נייטרלית ציפה 9 . עם זאת, יצירת דגימות גדולות ממספר גדול של טיפות קטנות בצורה שמפחיתה את נפח הריק – מקור חשוב לטעויות במדידות צפיפות פאזה זגוגיות קודמות – אינה טריוויאלית. עבור תערובות מימיות, התאדות דיפרנציאלי של מרכיבי פתרון במהלך aerosolization ותצהיר בתוך ואקום יכול להובילאי ודאויות משמעותיות בריכוזים שהופקדו.
פיתחנו שיטה, המבוססת על cryoflotation, המאפשר קביעת צפיפות מדויקת של תערובות מימיות באמצעות טיפות בודדים קטנים כמו 50 pL 10 . טיפות אלה יכולים להיות מקורר במהירות תוך שמירה על הריכוזים המקוריים שלהם, ואת מצב הטמפרטורה cryogenic שלהם (מזוקק או גבישיים) ניתן להעריך באמצעות assay חזותי פשוט כי בקורלציה עם מדידות עקיפה X- קרן. שיטה זו מיושמת באופן נרחב לתערובות מימיות ולא מימיות, וניתן להאריך אותה במגוון של דגימות ביולוגיות, כולל תאים ( למשל , גזע וביצה), דגימות רקמות וגבישי חלבון בעלי צפיפות טמפרטורה נמוכה בין 0.8 ל 1.4 גרם / מ"ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
המנגנון והשיטות הנוכחיים, שפותחו בעיקר על-ידי סטודנטים לתואר ראשון עם גישה מוגבלת לכלי ומכשירים לבניית מכשירים, מספקים בכל זאת מדידות צפיפות מדויקות ביותר עבור טיפות נוזלים בודדות קטנות כמו 50 pL. בטווח הריכוז ליד ומעל 50% w / w, כאשר שיעורי קירור קטנים מספיקים כדי לקבל דג…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NSF תחת פרס MCB-1330685. DWM מודה תמיכה חלקית של קורנל אוניברסיטת של אוניברסיטת מולקולרית ביופיסיקה הדרכה גרנט (NIH T32GM0082567).
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
Riferimenti
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -. C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
