Oocytes के सूक्ष्मदर्शन के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहे का उत्पादन
Summary
माउज़ ऑक्साइट्स का माइक्रोिनजेक्शन सामान्यतः दोनों क्लासिक ट्रांसजेनेसिस ( यानी, ट्रांसजेनेन्स का यादृच्छिक एकीकरण) और सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता वाले जीन लक्ष्यीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोइन्जेक्शन में नवीनतम घटनाओं की समीक्षा करता है, गुणवत्ता नियंत्रण और जीनोटाइपिंग रणनीतियों पर विशेष बल देता है।
Abstract
आनुवांशिक रूप से संशोधित चूहों के उपयोग ने विवो प्रक्रियाओं में शारीरिक और रोग दोनों पर अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया है। डीएनए अभिव्यक्ति के विस्फोटक इंजेक्शन उर्वरित ऑक्साइट्स में निर्माण होता है, अत्यधिक अव्यवस्था के लिए ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तकनीक है। जीन को लक्षित करने के लिए सीआरआईएसएसआर तकनीक की शुरुआत के साथ, निषेचित अयस्कों में विस्फोटक इंजेक्शन दोनों पीटा और नॉकिन चूहों की पीढ़ी तक बढ़ा दिया गया है। यह काम इंजेक्शन के लिए डीएनए की तैयारी और जीन लक्ष्यीकरण के लिए सीआरएसआरपी गाइड की पीढ़ी का वर्णन करता है, जो गुणवत्ता नियंत्रण पर विशेष बल देता है। संभावित संस्थापकों की पहचान के लिए आवश्यक जीनोटाइपिंग प्रक्रिया महत्वपूर्ण हैं। अभिनव जीनोटाइपिंग रणनीतियां जो कि सीआरआईएसपीआर की "बहुसंकेतन" क्षमताओं का लाभ उठाती हैं, यहां प्रस्तुत की जाती हैं। सर्जिकल प्रक्रियाओं को भी रेखांकित किया जाता है। साथ में, प्रोटोकॉल के चरण सामान्य जनरेशन के लिए अनुमति देगाएटिनीलॉजी, न्यूरोसाइंस, कैंसर, फिजियोलॉजी, डेवलपमेंट, और अन्य सहित, अनुसंधान क्षेत्रों के लिए एटिस्टिक रूप से संशोधित चूहों और माउस कॉलोनियों की बाद की स्थापना के लिए।
Introduction
मस्तिष्क और अपरिवर्तक दोनों में पशु मॉडल, अल्जाइमर रोग 1 , 2 जैसे मानव स्थितियों के रोगक्षेत्र विज्ञान की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे बीमारी संशोधकों की खोज के लिए अन्वेषण उपकरण भी हैं और अंततः इलाज की आशा में उपन्यास उपचार रणनीतियों का विकास करते हैं। हालांकि प्रत्येक मॉडल में आंतरिक सीमाएं हैं, पूरे सिस्टमिक मॉडल के रूप में पशुओं का उपयोग जैव-चिकित्सा अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है इसका कारण यह है कि चयापचय और जटिल शारीरिक वातावरण टिशू कल्चर में पूरी तरह से सिम्युलेटेड नहीं हो सकते।
तिथि करने के लिए, माउस आनुवांशिक हेरफेर के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम स्तनधारी प्रजातियां बनी हुई है क्योंकि इसमें कई फायदे हैं। बीमारियों से संबंधित शारीरिक प्रक्रियाएं और जीन चूहों और मनुष्यों के बीच अत्यधिक संरक्षित हैं मानव जीनोओ के एक साल पहले, पूरे जीनोम अनुक्रम (2002) के लिए माउस पहला स्तनधार थामे (2003) आनुवांशिक जानकारी के इस धन के अलावा, माउस को अच्छी प्रजनन क्षमताएं, एक तेजी से विकास चक्र (निषेचन के लिए 6 सप्ताह की मात्रा), और एक उचित आकार है। इन सभी फायदे, शारीरिक संकेतकों के साथ मिलकर, जैसे कि अलग कोट रंग (पार करने की रणनीति के लिए आवश्यक) ने माउस को आनुवांशिक हेरफेर के लिए एक आकर्षक मॉडल बना दिया। विशेषकर, आधुनिक आनुवंशिकी के शुरुआती युग में, ग्रेगर मेंडल ने पौधों में जाने से पहले चूहों पर काम करना शुरू कर दिया।
जीन ट्रांसफर तकनीक के परिणामस्वरूप तीन दशक पहले तीन ट्रांसजेनिक माउस की उत्पत्ति हुई थी, शुरू में वायरल डिलीवरी का उपयोग कर बनाया गया था। हालांकि, शोधकर्ताओं ने जल्द ही यह महसूस किया कि माउस ट्रांसजेनेसिस की मुख्य चुनौतियों में से एक बाहरी डीएनए के भाग्य को नियंत्रित करने में असमर्थता थी। चूंकि माउस oocytes में ट्रांसजेनेस की वायरल डिलीवरी परिणामस्वरूप कई प्रतियां जीनोम में अनियमित रूप से एकीकृत होती हैं, संभावनाबाद में ट्रांसजेनिक लाइनों की स्थापना के वाई सीमित थे।
एक ऐसी सीमा को दूर कर दिया गया जब गॉर्डन एट अल माइक्रोइंजेंसी 5 , 6 द्वारा पहली ट्रांसजेनिक माउस लाइन उत्पन्न की। इसने पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी का युग शुरू किया, और माइक्रोिनगेक्शन सत्र के परिणाम को प्रभावित करने वाले पैरामीटर का व्यापक अध्ययन किया गया है 7 । यद्यपि microinjection transgene के एकीकरण साइट (जो अंततः प्रत्येक संस्थापक माउस के लिए विशिष्ट अभिव्यक्ति के स्तर में परिणाम) पर नियंत्रण के लिए अनुमति नहीं देता है, हालांकि, एक्सक्ल्यूअम microinjection का मुख्य लाभ concatemers ( यानी, transgene की कई प्रतियों के arrays, श्रृंखला में जुड़ा हुआ है) जीनोमिक एकीकरण से पहले 5 हजारों ट्रांसजेनिक माउस लाइनों को स्थापित करने के लिए वर्षों में इस विशेषता का उपयोग किया गया है कि ब्याज की एक जीन को अस्वाभाव कीजिए। तब से, ट्रांसजेनेसिस, एएक जीव जीनोम के rtificial संशोधन, बड़े पैमाने पर रोगों की घटना में एक जीन की भूमिका की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है।
माउस जीनोम को छेड़छाड़ करने के लिए एक और महत्वपूर्ण उपलब्धि तब पहुंची थी जब मारियो केपकेची ने 8 में जीन लक्ष्यीकरण के युग को खोलकर सफलतापूर्वक माउस में एक एकल जीन को बाधित किया था। हालांकि, एसई कोशिका आधारित कोशिकाओं की चुनौतियों सहित ईएस कोशिका-आधारित जीन लक्ष्यीकरण से शीघ्रता से बड़ी खामियां निकलती हैं, कुछ प्रकार की चिमारीवाद की गति, और प्रक्रिया की लंबाई ( यानी, 12-18 महीने, न्यूनतम, माउस प्राप्त करने के लिए) ।
हाल ही में, नई प्रौद्योगिकियों में अग्रिम, जैसे इंजीनियर एंडोन्यूक्ल्यूज़ ( जैसे, जस्ता फिंगर न्यूक्लियोज़ज़ (जेडएफएन), ट्रांस्क्रिप्शन एक्टिवेटर-जैसे एफ़ायर न्यूक्लेअसेज़ (टीएएलएन), और संकुल नियमित रूप से अंतःस्थापित लघु रिल्लींड्रोमिक दोहराता (सीआरआईएसपी / सीएस 9) वैकल्पिक तरीकों के रूप में उभरा है Mic में जीन लक्ष्यीकरण की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिएई 9 , 10 इन एंडोन्यूक्ल्यूज़ को आसानी से माइक्रोएक्जेक्शन द्वारा माउस ओक्साइट्स में इंजेक्ट किया जा सकता है, जो कि 6 सप्ताह तक जीन-लक्षित चूहों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है।
जीनोम संपादन 11 के लिए सीआरआईएसपीआर के इस्तेमाल पर पहली रिपोर्ट के बाद से, यह बैक्टीरियल अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली ने अपने कई फायदे के कारण ज़ीडएफ़एन और टालेन को छोड़ दिया है, जिसमें संश्लेषण की आसानी और एक बार में कई जगहों को लक्षित करने की क्षमता शामिल है ("बहुसंकेतन ")। सीआरआईएसपीआर पहली बार चूहों 12 में जीन को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और उसके बाद से अनगिनत प्रजातियों के लिए पौधों से मनुष्यों 13 , 14 को लागू किया गया है। आज तक, सीआरआईएसपीआर जीनोम संपादन के प्रति प्रतिरोधी एक प्रजाति की कोई रिपोर्ट नहीं है।
ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी के दो मुख्य चरणों में oocytes और reimplantation के इंजेक्शन हैंछद्म गर्भवती मादाओं में इन oocytes की। यद्यपि इस तकनीक का हमारे द्वारा 15 और 16 अन्य लोगों द्वारा वर्णित किया गया है, हाल ही में माउस भ्रूणविज्ञान और जीन ट्रांसफर तकनीक में तकनीकी सुधार ने आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को पैदा करने की प्रक्रिया में क्रांति ला दी है। इन सुधारों को यहां वर्णित किया जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
आनुवांशिक रूप से संशोधित चूहों की पीढ़ी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है हालांकि, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक अनुकूलित और सरलीकृत विधि है जो एक को मास्टर करने औ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपने चल रहे समर्थन के लिए पशु सुविधा (बीआरसी) के स्टाफ का धन्यवाद करते हैं। यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद और ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
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