Комплексная система удаленно вызвать внутриклеточного сигнала по Upconversion наночастиц-опосредованной киназы Photoactivation
Summary
В этом протоколе, клетке протеинкиназа A (PKA), bioeffector трансдукции сигнала сотовой, иммобилизованных на поверхности наночастиц, microinjected в цитозоль и активированную upconverted УФ света от ближней ИК-области спектра (NIR) облучения, вызывая вниз по течению стресс волокна дезинтеграции в цитозоль.
Abstract
Upconversion наночастиц (UCNP)-опосредованной photoactivation представляет собой новый подход для удаленного управления bioeffectors с гораздо меньше Фототоксичность и глубокое проникновение в ткани. Однако существующие измерительные приборы на рынке не легко совместимы с приложением upconversion. Таким образом изменение коммерчески доступных инструмент имеет важное значение для этого исследования. В этой статье мы сначала проиллюстрировать изменения обычных fluorimeter и флуоресценции Микроскоп, чтобы сделать их совместимыми для фотонных upconversion экспериментов. Затем мы опишем синтез возле ИК-области спектра (NIR)-срабатывает клетке протеин киназы A каталитического субъединицы (PKA) иммобилизованных на UCNP комплекс. Сообщается также о параметры микроинъекции и НИР photoactivation процедур. После того, как клетке PKA-UCNP microinjected в REF52 фибробластов клетки, NIR облучения, который значительно превосходит обычные УФ облучения, эффективно вызывает PKA путь трансдукции сигнала в живых клетках. Кроме того положительной и отрицательной контроля эксперименты подтверждают, что PKA-индуцированной путь, ведущий к дезинтеграции стресс волокон специально инициируется NIR облучения. Таким образом использование белков модифицированных UCNP обеспечивает новаторский подход к удаленно контролировать свет модулированных клеточных экспериментов, в которых необходимо избегать прямого воздействия ультрафиолета.
Introduction
Химически модифицированных белков, которые могут быть photoactivated (например, белки PKA клетке) были разработаны как новые поля в химической биологии неинвазивно манипулировать межклеточных биохимические процессы1,2 ,3. С помощью света, как стимул обеспечивает отличное разрешение пространственно-временных при активации эти клетке белков. Однако УФ света может привести к нежелательным морфологические изменения, апоптоз и повреждение ДНК клеток4,5. Таким образом последние события в дизайн photocaging групп сосредоточена на включение photocleavage на больше длины волны или два Фотон возбуждения для уменьшения Фототоксичность, а также увеличить проникновение глубокой ткани6,7. Арретирование групп, которые отвечают больше длины волны, позволяя нам выбрать подходящий uncaging волн (т.е., каналы) выборочно активировать bioeffectors, когда два или более арретирование группы являются настоящей7. Учитывая эти полезные функции, разработка новых групп photocaging красный свет является очень важной подготовительной работы в фотохимических методологий для биологических исследований, начиная от прощупывания механизмов реакций для контроля клеточной деятельности8. Тем не менее двух Фотон арретирование группа обычно слишком гидрофобные благодаря структуре плавленого ароматическое кольцо, и видимый свет арретирование группа обычно металлоорганические, с ароматическими лигандами. Это свойство гидрофобные/ароматические не подходит, когда bioeffector белков и ферментов, как он денатурирует активация сайт белка фермента и приводит к потере функции, даже если спряжение и фотолиз по-прежнему работают на химическом уровне2 ,9.
UCNPs являются эффективным преобразователи, которые преобразуют свет возбуждения NIR УФ. Это уникальный и увлекательный свойство UCNPs предлагает реалистичные резолюций для решения проблем, связанных с photoactivation и вызвали контролируемого высвобождения малых молекул, включая фолиевой кислоты10, цисплатин производные11 ,12, сополимер везикулы13и полые частицы14ДНК/siRNA. Однако в меру наших знаний, при содействии UCNP photoactivation энзимов или протеинов не тестировалась так далеко. Потому что есть нет успешным примером использования красный свет или NIR фотоактивного фермент, мы были пробуждены для выполнения НИР срабатывает активации белка/фермента конструкции, состоящие из химически модифицированных клетках фермента комплексов с кремний покрытием, легированный лантаноиды UCNP15. В этом исследовании UCNP был проспряганное с быстро реагирующих киназы трансдукции сигнала в виде клетке PKA. PKA управляет синтеза гликогена и цитоскелета регулирование, которое реагирует на внешние раздражители через циклические аденозина фосфат (лагерь) регулирование в цитозоль16. Мы изучили возможности активации фермента в временных и пространственных формах в клеточном эксперимент после облучения НДК. Эта помощь UCNP photoactivation платформа является новой методологии photoactivate фермент, используя НИР и позволяет избежать нежелательного сигнала трансдукции ответ от клеток, вызванные обычным УФ облучения2,4.
Это очень трудно перемещать большие bioeffectors (например, белки) через клеточную мембрану для управления клеточную активность. Хотя лишенных подвижности частиц белка может быть легче перемещать через эндоцитоза в цитозоль, эндоцитоза могут быть повреждены или деградировали через от англ захвата и последующего лизосомальных деградации2,4. Даже если клетке белка до сих пор функционирует после транслокации мембраны, translocated суммы не могут быть достаточно, чтобы вызвать клеточный ответ2,17. В противоположность микроинъекции является прямым и количественный подход к доставить большие bioeffectors в цитоплазму клетки. Кроме того UCNP-прикол bioeffector требует upconverted свет, чтобы быть активированы. Таким образом оптическое приборостроение требует дальнейшего изменения измерения, визуализировать и использовать света upconversion. В этой работе будет подробно доставки клетке PKA-UCNP комплекса в ячейку с помощью микроинъекции и следующие основные изменения микроскопии и спектроскопии для NIR photoactivation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ранее Hofmann и coworkers обнаружил, что драматические морфологические изменения наблюдались в REF52 клетках после микроинъекции бесплатно PKA19. В другом исследовании Лоуренс группа продемонстрировала, что клетке PKA может быть активирована в естественных условиях, ведущих к мор…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Nano науки и технологии программы Синика и Министерство науки и технологий Тайваня за финансирование (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
Riferimenti
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -. D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells – Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
