Analyse af protein-proteininteraktioner og co-lokalisering mellem komponenter af gap-, stram- og adherensforbindelser i murine mammakirtler
Summary
Intercellulære kryds er krav til brystkirtelspecifikke funktioner og udvikling. Dette manuskript giver en detaljeret protokol til undersøgelsen af protein-protein-interaktioner (PPI'er) og co-lokalisering ved anvendelse af murine brystkirtler. Disse teknikker tillader undersøgelse af dynamikken i den fysiske forbindelse mellem intercellulære krydsninger på forskellige udviklingsstadier.
Abstract
Cellecelleinteraktioner spiller en afgørende rolle for bevarelse af vævsintegriteten og barrieren mellem de forskellige rum i brystkirtlen. Disse interaktioner tilvejebringes af forbindelsesproteiner, der danner sammenfald mellem tilstødende celler. Junctional protein mislokalisering og reducerede fysiske associationer med deres bindende partnere kan resultere i tab af funktion og følgelig til organ dysfunktion. Identifikation af proteinlokalisering og protein-protein-interaktioner (PPI'er) i normale og sygdomsrelaterede væv er således afgørende for at finde nye beviser og mekanismer, der fører til udviklingen af sygdomme eller ændringer i udviklingsstatus. Dette manuskript præsenterer en to-trins metode til evaluering af PPI'er i murine brystkirtler. I protokolafsnit 1 beskrives en fremgangsmåde til at udføre co-immunofluorescens (co-IF) ved anvendelse af antistoffer hævet mod proteiner af interesse efterfulgt af sekundære antistoffer mærket med fluorochromer. Selvom co-IF alleOws til demonstration af nærhed af proteinerne, gør det muligt at studere deres fysiske interaktioner. Derfor gives en detaljeret protokol for co-immunopræcipitation (co-IP) i protokolafsnit 2. Denne metode anvendes til at bestemme de fysiske interaktioner mellem proteiner uden at bekræfte, om disse interaktioner er direkte eller indirekte. I de sidste par år har co-IF og co-IP teknikker vist, at visse komponenter i intercellulære krydsninger samlokaliserer og interagerer sammen, hvilket skaber trinafhængige knudepunkter, der varierer under udvikling af brystkirtlen.
Introduction
Mammekirtlen vokser og udvikler sig primært efter fødslen. Dette organ ombygger sig selv hele tiden i et pattedyr 1 's reproduktive liv. Det voksne brystkirtleepitel består af et indre lag af luminale epithelceller og et ydre lag af basale celler, hovedsageligt sammensat af myopiteliale celler omgivet af en kældermembran 2 . For en god gennemgang af brystkirtels struktur og udvikling kan læseren henvise til Sternlicht 1 . Cellecelleinteraktioner via mellemrum (GJ), stramme (TJ) og adherens (AJ) krydsninger er nødvendige for den normale udvikling og funktion af kirtlen 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Hovedkomponenterne i disse kryds i den murine brystkirtlen er Cx26, Cx30, Cx32 og Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 og -7 ogZO-1 (TJ); Og E-cadherin, P-cadherin og β-catenin (AJ) 7 , 8 . Ekspressionsniveauerne af disse forskellige forbindelsesproteiner varierer på en trinafhængig måde under udvikling af brystkirtler, hvilket foreslår differentialcellecelleinteraktionskrav 9 . GJ, TJ og AJ er strukturelt og funktionelt forbundet og sammenkobler andre strukturelle eller regulatoriske proteiner til de tilstødende steder i tilstødende celler og derved skaber en forbindelsesnekke 10 . Sammensætningen af den forbindelsesmæssige nexus kan påvirke brodannelsen med det underliggende cytoskelet såvel som nexuspermeabilitet og stabilitet og kan følgelig påvirke funktionen af kirtlen 8 , 9 , 10 , 11 . Komponenterne i intercellulære krydsninger, der befinder sig i krydsede nexuser eller interagerer med hinanden ved difHjerteudviklingsstadier af udvikling af brystkirtler blev analyseret for nylig ved anvendelse af co-immunofluorescens (co-IF) og co-immunpræcipitation (co-IP) 9 . Mens andre teknikker tillader evaluering af den funktionelle association mellem proteiner, er disse metoder ikke præsenteret i dette manuskript.
Da proteiner kun virker alene for at fungere, er det vigtigt for mange forskere at studere protein-protein-interaktioner (PPI'er), såsom signaltransduceringer og biokemiske kaskader, og kan give væsentlig information om proteinernes funktion. Co-IF og mikroskopisk analyse hjælper med at evaluere et par proteiner, der deler det samme subcellulære rum. Antallet af mål er imidlertid begrænset af antistofferne, som skal opdrættes i forskellige dyr og ved adgangen til et konfokalt mikroskop udstyret med forskellige bølgelængderlasere og en spektral detektor til multiplexering. Co-IP bekræfter eller afslører høj affinitet fysiske interaktioner betwEn to eller flere proteiner, der ligger inden for et proteinkompleks. På trods af udviklingen af nye teknikker, såsom fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) 12 og nærhedsligeringsassay (PLA) 13 , som samtidig kan detektere lokalisering og interaktioner af proteiner, forbliver co-IP en passende og overkommelig teknik til undersøgelse af interaktioner mellem Endogene proteiner.
Den trinvise fremgangsmåde beskrevet i dette manuskript vil lette undersøgelsen af proteinlokalisering og PPI'er og påpege faldgruber for at undgå, når man studerer endogene PPI'er i brystkirtlerne. Metoden starter med præsentationen af de forskellige bevarelsesprocedurer for de krævede væv til hver teknik. Del 1 præsenterer, hvordan man studerer protein co-lokalisering i tre trin: i) snittet af brystkirtler, ii) dobbelt- eller tredobbelt mærkning af forskellige proteiner ved hjælp af co-IF-teknikken, og iii) billeddannelsen afProtein lokalisering. Del 2 viser, hvordan man udfælder et endogent protein og identificerer dets interagerende proteiner i tre trin: i) lysatpræparation, ii) indirekte proteinimmunpræcipitation og iii) bindingspartneridentifikation ved SDS-PAGE og Western blot. Hvert trin i denne protokol er optimeret til gnavere af brystkirtler og genererer højkvalitetsspecifikke og reproducerbare resultater. Denne protokol kan også bruges som udgangspunkt for PPI-studier i andre væv eller cellelinier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell-celle interaktioner via kryds er nødvendige for den korrekte funktion og udvikling af mange organer, såsom brystkirtlen. Undersøgelser har vist, at forbindelsesproteiner kan regulere funktionen og stabiliteten af hinanden og aktivere signaltransduktion ved at tinde hinanden ved cellemembranen 10 . De protokoller, der er præsenteret i det nuværende manuskript, har givet interessante fund om sammenfaldende protein-differentialekspression, lokalisering og interaktion under normal udv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IP finansieres af et stipendium fra naturvidenskab og ingeniørforskning fra Canada (NSERC # 418233-2012); Et Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), en Quebec Breast Cancer Foundation karrierepris og et Leader Founds-tilskud fra Canadian Foundation for Innovation grant. ED modtog et stipendium fra Fondation Universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
Riferimenti
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
