ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה
Summary
פרוטוקול זה מספק ניתוח של subplopulations macrophage במערכת העצבים המרכזית עכבר מבוגר על ידי cytometry הזרימה והוא מועיל לחקר סמנים מרובים לידי ביטוי על ידי תאים אלה.
Abstract
מחקרים רבים הוכיחו את תפקודם של תאי החיסון, ובמיוחד מקרופאגים, בפתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). ישנן שתי אוכלוסיות מקרופאגיות עיקריות במערכת העצבים המרכזית: (i) המיקרוגלים, שהם המקרופאגים של ה- CNS, והם נגזרים מאבות שק החלמון במהלך אמבריוגנזה (2), המקרופאגים הנגזרים מונוציטים (MDM), אשר יכולים לחדור CNS במהלך המחלה נגזרים אבות מח עצם. התפקידים של כל subopopulation מקרופאג שונים בהתאם הפתולוגיה הנלמדת. יתר על כן, אין הסכמה על סמנים היסטולוגיים או הקריטריונים המבדילים המשמשים subpopulations מקרופאגים אלה. עם זאת, ניתוח של פרופילי הביטוי של CD11b ו CD45 סמנים על ידי cytometry הזרימה מאפשר לנו להבדיל microglia (CD11b + CD45 med ) מ MDM (CD11b + CD45 גבוהה ). בפרוטוקול זה, אנו מראים כי צנטריפוגה צפיפות שיפועואת זרימת cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לאפיין אלה subpopulations מקרופאס CNS, וכדי ללמוד מספר סמנים של עניין לידי ביטוי על ידי תאים אלה כפי שפורסם לאחרונה. לכן, טכניקה זו יכולה לקדם את ההבנה שלנו את התפקיד של מקרופאגים מודלים העכבר של מחלות נוירולוגיות והוא יכול לשמש גם כדי להעריך את ההשפעות על התרופה תאים אלה.
Introduction
Microglia הם מקרופאגים תושב רקמת parenchymal של מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם משחקים שני תפקידים מרכזיים תפקודית: ההגנה החיסונית ותחזוקה של הומאוסטזיס CNS. בניגוד ל- MDM, המתחדשים ללא הרף מתאי גזע ההמטופויטים במוח העצם, תאי המיקרוגליאל נבדלים מתאי האב הקדמון הפרימיטיביים שמקורם בשק החלמון (YS) שהתיישב במוח במהלך התפתחות עובריים 1 , 2 , 3 . במכרסמים, גורם שעתוק Myb ממלא תפקיד מכריע בפיתוח של כל מונוציטים מקרופאגים מוח העצם נגזר, אבל עבור YS נגזר microglia, גורם זה הוא dispensable ו הבחנה נשאר תלוי גורם שעתוק PU.1 4 .
ב CNS בריא, microglia הם תאים דינמיים כי כל הזמן מדגם הסביבה שלהם, scaNning ו מדידות עבור פתוגנים פולשים או נזק לרקמות 5 . גילוי של אותות כאלה יוזם מסלול לפתרון הפציעה. המיקרוגליה עוברת במהירות ממורפולוגיה מסועפת לאחת אמבואידית, ואחריה פגוציטוזיס ושחרור של מתווכים שונים, כגון ציטוקינים פרו-או אנטי-דלקתיים. לפיכך, בהתאם microenvironment שלהם, microglia מופעל יכול לרכוש מגוון רחב של מדינות פרימינג מובהק 6 .
Microglia השפעה עמוקה על התפתחות והתקדמות של הפרעות נוירולוגיות רבות. במודלים המכרסמים של מחלת אלצהיימר (AD), 7 , טרשת נפוצה (ALS) 8 , טרשת נפוצה (MS) 9 או מחלת פרקינסון (PD) 10 , המיקרוגליה מתבטאת בתפקוד כפול, או בהופעת נוירוטוקסיות מזיקה או משחק באופן נוירו-יציבותי, התלותיאת המחלה הספציפית, את שלב המחלה, והאם המחלה הושפעה על ידי תא החיסון המערכתי 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . רוב נגעים CNS שנצפתה במחלות שצוטטו לעיל מכילים אוכלוסיה הטרוגנית של תאים מיאלואידים, כולל לא רק microglia parenchymal, אלא גם מקרופאגים perivascular ו מאנגיאל, כמו גם MDM חדירת CNS. סוגי תאים אלה עשויים לתרום באופן דיפרנציאלי למנגנונים הפתופיזיולוגיים הקשורים לפציעה ולתיקון 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . האתגר הנוכחי לחוקרים הלומדים מודלים אלה של המחלה הוא לקבוע אם מונוציטים הפריפריה מקרופאגים לחדור CNS ואם כן, כדי distלהכניע את המיקרוגליה של התאים האלה. ואכן, תאים microglial הם פלסטיק מאוד; כאשר הם מופעלים, microglia מחדש להביע סמנים שבדרך כלל לידי ביטוי על ידי מונוציטים היקפיים מקרופאגים. הנושא, אם כן, מסתמך על זיהוי סמנים שיכולים להבחין בין microglia תושב מן מונוציטים חדרו מקרופאגים.
האפליה של אוכלוסיות אלה על פרוסות המוח על ידי יישומים אימונוהיסטולוגיים מוגבל בשל חוסר נוגדנים ספציפיים. עם זאת, ניתוח cytometry זרימה היא טכניקה יעילה כדי להעריך את הביטוי של כמה סמנים להבדיל אוכלוסיות תאים (למשל, לימפוציטים, מקרופאגים / MDM CD11b + CD45 גבוה , microglia CD11b + CD45 med ), כמו גם תת subpopulations 16 , 17 , 18 . פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לבידודתאים mononuclear מ CNS העכבר במודלים של מחלות נוירולוגיות באמצעות ניתוק אופטימלי, אנזימטי רקמות צנטריפוגה צפיפות שיפוע; כמו גם, שיטה לבידול מיקרוגליה ו – MDM אוכלוסיות ב CNS באמצעות cytometry הזרימה.
גישה נוספת היא לחסל את myelin ולטהר את התאים באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדות נוגדנים ספציפיים 19 , 20 , 21 . הסרת Myelin באמצעות חרוזים מגנטיים anti-myelin הוא יקר יותר משפיע על הכדאיות והתשואה של תאים מבודדים 22 . צעד זה ואת ההפרדה החיסונית הבאה של microglia, להגביל מחקרים נוספים של אוכלוסיות תאים ספציפיים החיסון 21 , 22 .
נהלים אלה מספקים דרך קלה ללמוד את subcopulations macrophage בפיתוח מחלות, וכדי לקבוע את השפעות התרופה או שינויים גנים על פנוטיפים מקרופאג ומצבי הפעלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הוכח כי microglia ו MDM יש פונקציות שונות פנוטיפים במערכת העצבים המרכזית, ולכן זיהוי וניתוח של subopopulations מקרופאגים אלה חיוניים על מנת להבין טוב יותר מחלות נוירולוגיות 9 , 18 , 25 . זרימת cytometry ניתוח באמצעות שני סמנים (CD11b ו CD45) מא?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ הסוכנות הלאומית להפלגה Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), האגודה הצרפתית אלצהיימר Bpifrance. המעבדה שלנו נתמכת גם על ידי Inserm, CNRS, אוניברסיטת Pierre et Marie-Curie והתוכנית "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). ברצוננו להודות לעזרתו של CELIS תא התרבות הליבה מתקן.
Materials
| 5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
Riferimenti
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?. Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson’s disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer’s disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
