Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo
Summary
Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.
Abstract
As doenças neurodegenerativas muitas vezes têm um impacto devastador sobre os afetados. A perda de células ganglionares retinianas (RGC) está implicada em uma série de doenças, incluindo retinopatia diabética e glaucoma, além do envelhecimento normal. Apesar da sua importância, os RGCs têm sido extremamente difíceis de estudar até agora devido em parte ao fato de que eles compreendem apenas uma pequena porcentagem da grande variedade de células na retina. Além disso, os métodos de isolamento atuais usam marcadores intracelulares para identificar RGCs, que produzem células não viáveis. Essas técnicas também envolvem longos protocolos de isolamento, portanto, há uma falta de métodos práticos, padronizados e confiáveis para obter e isolar RGCs. Este trabalho descreve um método eficiente, abrangente e confiável para isolar RGC primários de retinae de camundongos usando um protocolo baseado em critérios de seleção positivos e negativos. Os métodos apresentados permitem o estudo futuro de RGCs, com o objetivo de melhor compreender o maiorDeclínio na acuidade visual que resulta da perda de RGCs funcionais em doenças neurodegenerativas.
Introduction
Os RGCs são neurônios terminalmente diferenciados e, portanto, células primárias são necessárias para a experimentação. O desenvolvimento de um protocolo para isolamento e enriquecimento de células de gânglios retinianos murinos primários (RGCs) é fundamental para revelar os mecanismos de saúde e degeneração de RGC in vitro . Isto é especialmente importante para estudos que buscam gerar terapias potenciais para promover a função RGC e para minimizar sua morte. A degeneração de RGCs está associada a doenças degenerativas da retina, como glaucoma, retinopatia diabética e envelhecimento normal. Embora os mecanismos celulares específicos subjacentes à perda de RGC não estejam claros, uma série de fatores de risco foram identificados. A falta de oxigenação na cabeça do nervo óptico 1 , 2 , 3 causa a morte RGC 4 e atua como o distúrbio da homeostase entre a ativação de excitatório e iReceptores nibitórios dentro de RGCs individuais 5 , 6 . Uma série de desafios impede o progresso no sentido do uso dessas células para estudos aprofundados. Primeiro, o número de RGCs presentes em uma retina murina é pequeno. Os RGCs representam menos de 1% das células da retina 7 , 8 , 9 . Em segundo lugar, a maioria dos marcadores específicos de RGC são proteínas intracelulares 10 , 11 , 12 . A seleção com base nesses marcadores deixa as células não viáveis, o que impede análises funcionais a jusante. Finalmente, os protocolos atualmente disponíveis são longos e falta padronização 13 , 14 . Os protocolos de isolamento RGC precoce basearam-se em métodos de imunoparingologia. Barres et al. 15 Adaptou o immunop clássicoE acrescentou um segundo passo, que excluiu os monócitos e as células endoteliais da maior parte das células da retina antes da seleção positiva com base na imunopositividade ao antígeno anti-timócito (também conhecido como Thy1), um marcador de superfície celular. Anos mais tarde, Hong et al. Técnicas combinadas de isolamento de grânulos magnéticos com estratégias de triagem celular para isolar RGC com maior pureza 16 . O uso de pérolas magnéticas ainda é usado em muitas aplicações científicas. Juntos, os grânulos magnéticos e os protocolos de citometria de fluxo melhoraram a pureza das células isoladas. No entanto, estes sistemas de purificação ainda não foram padronizados para o isolamento de RGC murinos a partir de retina dissociada.
A citometria de fluxo é um poderoso método analítico que mede as características ópticas e fluorescentes das suspensões celulares. As células são analisadas quantitativa e qualitativamente com um alto nível de sensibilidade, fornecendo uma análise multidimensional da população celularAtion. A discriminação celular baseia-se em duas propriedades físicas principais: tamanho da célula ou área de superfície e granularidade ou complexidade interna 17 . Uma análise multidimensional pode ser realizada combinando anticorpos marcados com fluorocromos que possuem comprimentos de onda de excitação semelhantes e diferentes emissões. A citometria de fluxo é rápida, reproduzível e sensível. Os laseras Multitpe permitem análises multidimensionais ainda maiores de células individuais por citometria de fluxo. Assim, é uma metodologia atraente para o estudo de espécimes citológicos. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) usa as diferenças fenotípicas multidimensionais identificadas pela citometria de fluxo para classificar células individuais em subpopulações distintas.
Na última década, múltiplas proteínas superficiais e intracelulares foram identificadas como biomarcadores potenciais para a seleção de células, incluindo neurônios. Estudos iniciais que procuraram isolar RGCs de ratos usaram Thy1 como um ganglion celL marcador. Infelizmente, Thy1, também conhecido como CD90, tem múltiplas isoformas em outras espécies de roedores 18 , 19 , 20 e é expresso por vários tipos de células da retina 19 , 20 , tornando-se um marcador não específico para RGCs. Outro marcador de superfície, CD48, é encontrado em populações monocíticas na retina, incluindo macrófagos e microglia. Usando estes dois marcadores de superfície, uma assinatura RGC modificada – células Thy1 + e CD48 neg – foi desenvolvida 15 , 16 , 21 , 22 . Infelizmente, esses dois critérios de seleção não são suficientes para selecionar uma população RGC altamente enriquecida. Para resolver esta necessidade não atendida, foi desenvolvido um protocolo de citometria de fluxo 23 com base em critérios de seleção positiva e negativa de várias camadas usiNg conhecidos marcadores de superfície celular para enriquecer e purificar RGCs murinos primários.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS é a técnica de escolha para purificar populações celulares. Outros métodos de isolamento incluem imunopanning, esferas magnéticas e depleção de fixação do complemento. A vantagem do FACS sobre essas outras metodologias baseia-se na identificação simultânea de marcadores de superfície celular com diferentes graus de intensidade. A intensidade fluorescente da molécula é proporcional à quantidade de expressão da proteína. Até agora, o isolamento de RGCs baseava-se unicamente na positividade Thy1 (C…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Sr. Tim Higgins, Ilustrador Sénior do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Bioquímica, para assistência técnica em vídeo; Dr. Matthew W. Wilson para discussões e os membros dos laboratórios Jablonski e Morales-Tirado por seus comentários úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), a Fundação de Pesquisa da Universidade do Tennessee (VMM-T), o National Eye Institute EY021200 (MMJ), o Gerwin Fellowship (VMM-T); A Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), o Departamento de Defesa Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T), e a concessão irrestrita da pesquisa para prevenir a cegueira.
Materials
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20x objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
Riferimenti
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