Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화
Summary
설치류의 유선 선생 발달은 일반적으로 기술적 평가를 사용하거나 기본적인 신체적 속성을 측정하여 평가되었습니다. 분지 밀도는 객관적으로 정량화하기 어려운 유방 발달의 지표입니다. 이 프로토콜은 유선의 분기 특성의 정량 평가를위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다.
Abstract
점점 더 많은 수의 연구가 설치류 유선을 화학 물질 노출의 발달 독성을 평가하기위한 종점으로 이용하고있다. 이러한 노출이 유선 분화에 미치는 영향은 일반적으로 기본 치수 측정을 사용하거나 형태 학적 특성을 채점하여 평가됩니다. 그러나 발달 변화를 해석하는 광범위한 방법은 실험실 간 일관성없는 번역을 초래할 수 있습니다. 연구를 통해 비교되는 데이터로부터 적절한 해석이 형성 될 수 있도록 일반적인 평가 방법이 필요합니다. 본 연구는 유선의 분지 특성을 정량화하기위한 Sholl 분석 방법의 적용을 기술한다. Sholl 방법은 원래 신경 돌기 패턴을 정량화하는데 사용하기 위해 개발되었습니다. 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 패키지 인 ImageJ와이 분석을 위해 개발 된 플러그인을 사용하여 유선 분지 밀도와 am혈관 주위 암컷 쥐의 유선이 결정되었다. 여기에 설명 된 방법은 유선 개발의 중요한 특성을 정량화하기위한 효과적인 도구로 Sholl 분석의 사용을 가능하게합니다.
Introduction
유선 분지는 일반적으로 분비선 발달의 지표로 평가되는 특성이지만 객관적으로 정량화하기는 어렵습니다. 1953 년에 Sholl 1 은 고양이의 시각 및 운동 피질에서 신경 연결 돌기 arborization을 측정하는 방법을 설명했으며,이 기술을위한 플러그인은 Ferriera 등 2에 의해 개발되었습니다. 뉴런과 유선 모두 유사한 나무와 유사한 구조를 나타 내기 때문에,이 플러그인은 혈관 주위 쥐 유선의 2D 이미지에서 유방 상피 분지 밀도를 정량화하기 위해 사용되었습니다. 생후기가 학업 실험실 및 시험 가이드 라인 연구에서 종종 평가되는 생활 단계이기 때문에 주변기 단계는 분석을 위해 선택되었습니다. Sholl 분석은 추가 플러그인이 포함 된 오픈 소스 이미지 처리 패키지 인 ImageJ 인 FIJI와 함께 배포되는 플러그인입니다. 플러그인은 predef를 둘러싼 일련의 동심원 반지름을 만듭니다.ined center (전형적으로는 신경 세포의 soma 또는 유선의 1 차관의 기원)과 물체의 distal-most 부분 (enclosing radius)으로 확장된다. 그런 다음 각 링에서 발생하는 교차 수 (N)를 계산합니다. 플러그인은 Sholl 회귀 계수 ( k )를 반환하는데, 이는 상피 분지의 붕괴 속도를 측정합니다.
ImageJ를 사용하여 유선 전체 이미지의 골격화 된 이미지가 생성되고 유방 상피 영역 (MEA)이 측정됩니다. Sholl 분석 플러그인을 사용하여 이미지를 분석하고 여기서 사용하지 않은 다른 값 중 N 및 k 값이 반환됩니다. 유방 상피 분화 밀도는 N / MEA를 계산하여 결정됩니다. 선 상피의 바깥 쪽 영역에서 분지가 계속되는 정도는 분기 복잡성이며 균일 한 원위 상피 성장의 지표입니다. k 는 epith에서 원위부 감소의 척도이므로그것은 분지 복잡성과 유방 발달의 확실한 지표의 효과적인 척도이다.
이 프로토콜은 유선 전체 마운트의 골격화 이미지를 생성하고 peripubertal 남성과 여성의 쥐의 유방 분기 특성을 정량적으로 평가하기위한 컴퓨터 보조 방법을 설명합니다. 이 방법은 상대적으로 빠르며 전문화 된 현미경 장비를 사용할 필요가 없습니다. 이 방법의 개발 및 검증은 Stanko et al. (2015) 3 . 이 보고서는 또한 쥐 유선 전체 = 마운트의 준비를 설명합니다. 유사한 유방 전체 마운트 절차가 Assis et al. (2010) 4 및 Plante et al. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
출생부터 사춘기까지 유선의 성장은 알로 메트릭입니다. 사춘기 후, 유선은 광범위한 지방 분지 및 신장을 통해 발생하며 유방 상피가 전체 지방 패드를 차지할 때까지 계속됩니다. 분지 특성은 유선 개발의 중요한 측면이며, 이러한 특성을 객관적으로 정량화하는 능력은 정상적인 유방 발달을 평가하고 유방 내 독성 물질에 일생 초기 노출 후 비정상적인 발달을 확인하는 데 매우 유용 할 수 있?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 방법과 Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada) 박사의 지속적인 도움을 받아 Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC)을 인정하고 싶습니다. Sholl 응용 프로그램에 대한 지원.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
Riferimenti
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