タンパク質結晶の微結晶化および<em>セルロで</em>回折
Summary
タンパク質微結晶を用いたX線結晶解析のためのプロトコールが提示されている。精製後又はcelluloにおける微結晶-grown インビボで分析する2つの例が比較されます。
Abstract
多くのシンクロトロン施設で高品質のマイクロフォーカスビームラインが出現したことにより、最大の次元で10μm以下の結晶の日常的な解析が可能になりました。本発明者らは、X線結晶学によるタンパク質微結晶の構造決定のための2つの代替のワークフローを提示し、特にin vivoで成長した結晶に焦点を当てる。微結晶は、超音波処理によって細胞から抽出され、微分遠心分離によって精製されるか、または結晶含有細胞のフローサイトメトリーによる細胞選別の後、セルロで分析される。場合によっては、精製された結晶または結晶含有セルを、実験段階的な調整のために重原子溶液に浸漬する。これらの試料は、マイクロメッシュ支持体上に塗布し、液体窒素中でフラッシュ冷却することにより同様の方法で回折実験用に調製する。我々は、単離された微結晶および結晶質結晶の連続回折実験を簡単に説明し、モデル構築および精密化に適したデータセットを生成するためにマイクロフォーカスシンクロトロンビームラインを使用している。
これらのワークフローは、昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることによって産生されるBombyx mori cypovirus 1（BmCPV1）ポリヘドリンの結晶で例示される。このケーススタディでは、セルロ分析では精製された結晶の分析よりも効率的であり、発現から精製まで約8日間で構造が得られます。
Introduction
生物学的高分子の高分解能構造の決定のためのX線結晶学の使用は、過去20年間にわたり安定した進行を経験している。非専門家による研究者によるX線結晶学の益々の取り込みは、ライフサイエンスの多くの分野におけるこのアプローチの民主化を実証している1 。
歴史的に、約10μm以下の寸法を有する結晶は、構造決定のために使用できないとしても、困難であると考えられてきた。世界的なシンクロトロン放射源の専用マイクロフォーカスビームラインの利用可能性と、微結晶を操作するためのツールの開発などの技術的進歩により、X線マイクロ結晶の幅広い利用を妨げてきた多くの障壁が取り除かれました。シリアルX線microcrystallography 2,3及びマイクロ電子回折4ヘクタールの進歩構造決意用マイクロおよびナノ結晶の使用が可能でなく、大きな結晶5、6、7の使用に時々好ましくないだけであることが示されまし。
これらの進歩は、第一のペプチド8及び昆虫ウイルス9、10によって生成される天然の結晶の研究に適用しました。それらは現在、膜タンパク質や大きな複合体などの最も難しい系を含む多様な生物学的巨大分子に使用されています11 。これらの微結晶の分析を容易にするために、それらはメソ 、特に膜タンパク質12およびマイクロ流体チップ13において分析されている。
これらの新規な微結晶化方法の利用可能性は、古典的なインビトロ crystallogenesisに代わるものを提供する構造生物学14、15、16のための新たな経路として結晶体内。残念なことに、 インビボ結晶が産生されても、細胞からの精製中のリガンドの分解または喪失、シンクロトロンビームラインでの結晶の操作および視覚化の困難さ、退屈なX線回折実験などのいくつかの障害が残る。別の結晶はまた、任意の精製工程17、18、19せずに細胞内で直接分析されているように。比較分析はcelluloアプローチにおけるように精製された結晶およびより高い解像度20の収率データの分析よりも効率的であることを示唆しています。
このプロトコルはタンパク質微結晶学の新しい研究者を支援する傾向があった。それは、シンクロトロンビームラインでのX線回折実験のための試料調製および操作に焦点を当てた方法論を提供する。 2つの選択肢が、古典的な微結晶学のための単離された結晶またはフローサイトメトリーによってソーティングされた結晶含有細胞を用いて、セルロ分析で提案されている（ 図1 ）。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、過去に見過ごされていた非常に小さな結晶の分析を容易にする目的で、微結晶を分析する2つのアプローチを提供する。
微結晶の浄化のための重要なステップ
提示されたプロトコールは、モデル系としてSf9細胞で発現されたボンビクス・モリ CPV1ポリヘドリンを用いて最適化されている。しかしながら、 in vivo微結晶は?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、オーストラリアシンクロトロンのMX2ビームラインでの支援のために精製微結晶、Daniel ErikssonとTom Caradoc-Daviesの写真を提供するChan-Sien Layと、Monash UniversityのFlowCore施設からのKathryn FlanaganとAndrew Fryga貴重な援助。
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
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