Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann
Summary
Existen células del estroma de la médula (MSC) con potencial neural dentro de la médula ósea. Nuestro protocolo enriquece esta población de células a través de un preacondicionamiento hipóxico y luego las dirige a convertirse en células maduras de Schwann.
Abstract
Este manuscrito describe un medio para enriquecer a progenitores neurales de la población de células estromales de médula (MSC) y posteriormente dirigirlos al destino maduro de células de Schwann. Se sometieron las MSC de rata y humana a condiciones hipoxicas transitorias (1% de oxıgeno durante 16 h), seguido de expansión como neurosferas sobre su- plemento de unión baja con factor de crecimiento epidérmico (EGF) / suplemento de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). Las neurosferas se sembraron en un plástico de cultivo de tejidos recubierto con poli-D-lisina / laminina y se cultivaron en un cóctel gliogénico que contenía β-Heregulina, bFGF y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) para generar células similares a células de Schwann (SCLC). Los SCLC se dirigieron al compromiso de destino a través del cocultivo durante 2 semanas con neuronas purificadas de ganglios de la raíz dorsal (DRG) obtenidas de ratas Sprague Dawley gestantes E14-15. Las células maduras de Schwann demuestran persistencia en la expresión de S100β / p75 y pueden formar segmentos de mielina. Las células generadas de esta manera tienen potencialEn el trasplante de células autólogas después de la lesión de la médula espinal, así como en el modelado de la enfermedad.
Introduction
El trasplante de progenitores neurales y sus derivados demuestra la promesa como una estrategia de tratamiento después de la lesión nerviosa traumática 1 , 2 y la neurodegeneración [ 3 , 4] . Antes de la aplicación clínica, es esencial asegurar: i) un método para acceder y expandir sobre una fuente autóloga de células madre / progenitoras y ii) un medio para dirigirlos a tipos de células maduras relevantes 3 . Nuestro interés en la terapia celular para la lesión de la médula espinal nos llevó a buscar una robusta, autóloga célula fuente de progenitores neurales de tejidos adultos.
Una subpoblación de MSC se origina en la cresta neural y es fácilmente accesible desde la cavidad de la médula. Estas células son progenitores neurales que pueden generar neuronas y glia [ 5] . Modelos animales de isquemia cerebral demuestran que la hipoxia promueve el prol Iferation y multipotencia de progenitores neurales dentro del cerebro 6 . Ésta fue la base para utilizar el preacondicionamiento hipóxico como un medio de expansión sobre los progenitores neurales derivados de la médula.
El trasplante de células de Schwann en la médula espinal lesionada promueve la regeneración 2 . Los SCLC pueden generarse a partir de MSC mediante la suplementación con factores gliogénicos ( es decir, β-Heregulin, bFGF y PDGF-AA), pero muestran inestabilidad fenotípica. Tras la retirada de factores de crecimiento, que volver a un fenotipo fibroblasto- 7 . La inestabilidad fenotípica es indeseable en el trasplante de células debido al riesgo de diferenciación aberrante y carcinogénesis. Como los precursores de células de Schwann se asocian con haces axónicos dentro del nervio periférico embrionario 8 , se nos llevó a SCLC cocultivo con neuronas DRG embrionarias purificadas 7 ,Asno = "xref"> 9. Las células de Schwann maduras resultantes están comprometidas con el destino y demuestran su función in vitro 7 , 9 e in vivo 10 .
Nuestro protocolo para el enriquecimiento de progenitores neurales de MSCs es simple y eficiente y resulta en un aumento en el número de células para los ensayos posteriores. La derivación de células de Schwann comprometidas con el destino a través de la plataforma de cocultivo permite el estudio de la diferenciación glial y la generación de células estables y funcionales de Schwann para su posible aplicación clínica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es esencial para preservar el "stemness" de MSCs antes del enriquecimiento de progenitores neurales a través de precondicionamiento hipóxico y neurosphere cultura. A partir de nuestra experiencia, MSC multipotentes pueden ser identificados de forma fiable por su morfología de tipo fibroblastos alargada. Por el contrario, las MSC que han adoptado una morfología cuadrangular más aplanada, con fibras prominentes de estrés citoesquelético, no adoptan fácilmente los destinos celulares neuronales y deben ser…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Nai-Sum Wong por proporcionar el aparato de cámara de hipoxia ya la Sra. Alice Lui por el apoyo técnico.
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
Riferimenti
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