Новая методика трансплантации молочной жировой ткани для визуализации образования сосудов сосудистых эндотелиальных стволовых клеток
Summary
Эта работа демонстрирует новый подход к оценке пролиферации, дифференцировки и сосудообразующего потенциала сосудистых эндотелиальных стволовых клеток (VESC) посредством трансплантации молочной жировой ткани с последующим тщательным приготовлением тканей для микроскопического наблюдения. Также представлена стратегия трассировки линий для исследования поведения VESC in vivo .
Abstract
Эндотелиальные клетки (EC) являются фундаментальными строительными блоками сосудистой архитектуры и опосредуют рост сосудов и ремоделирование для обеспечения надлежащего развития сосудов и гомеостаза. Однако исследования по иерархии линий эндотелия остаются неуловимыми из-за отсутствия инструментов для получения доступа, а также для непосредственной оценки их поведения in vivo . Чтобы устранить этот недостаток, была разработана новая модель ткани для изучения ангиогенеза с использованием молочной жировой прокладки. Молочная железа развивается в основном на постнатальных стадиях, включая половое созревание и беременность, во время которых ростовая пролиферация эпителия сопровождается обширным сосудистым ремоделированием. Маммовые жировые подушки обеспечивают пространство, матрицу и богатые ангиогенные стимулы от растущего эпителия молочной железы. Кроме того, прокладки молочных жиров расположены за пределами брюшной полости, что делает их доступным для трансплантации местом для оценки ангиогенного потенциала экзогенных клеток. Эта работа также описывает эффективностьNt с использованием флуоресцентных репортерных мышей для специфической маркировки целевой популяции сосудистых эндотелиальных стволовых клеток (VESC) in vivo . Этот метод отслеживания линии, в сочетании с последующей микроскопией всего тела, позволяет непосредственно визуализировать целевые клетки и их потомков, через которые можно количественно определить способность распространения, а обязательства по дифференциации могут быть сопоставлены судьбой. Используя эти методы, популяция бипотентного рецептора белка С (Procr), экспрессирующего VESC, недавно была идентифицирована в нескольких сосудистых системах. Procr + VESC, приводящие к появлению как новых EC, так и перицитов, активно способствуют ангиогенезу во время развития, гомеостаза и ремонта повреждений. В целом, эта рукопись описывает новую трансплантацию молочной жировой ткани и методы трассировки линии in vivo , которые могут быть использованы для оценки свойств стволовых клеток VESC.
Introduction
Во время развития и гомеостаза сосудистый рост и ремоделирование добросовестно происходят в соответствии с ростом и восстановлением органов. Ангиогенез описывает генерацию новых сосудов из ранее существовавших кровеносных сосудов и считается основной силой, опосредующей эти динамические сосудистые изменения. Каждый кровеносный сосуд внутренне облицован слоем эндотелиальных клеток (EC), и они, по-видимому, являются основой архитектуры судна. Долгое время механизм, по которому ЕС-бассейн пополнялся во время гомеостаза, оставался неясным, и были высказаны аргументы в пользу того, является ли сосудистый оборот результатом зрелой пролиферации ЕС или является вкладом в деятельность сосудистых стволовых клеток / клеток-предшественников. Из-за отсутствия прямых физиологических доказательств существование и клеточная идентичность сосудистых эндотелиальных стволовых клеток (VESC) также оставались спорными.
Одним из наиболее распространенных подходов, используемых для проверки поведения стволовых клеток, является транспланВ отношении предполагаемых стволовых клеток к мышам-реципиентам. Этот метод измеряет потенциал стельности потенциальных стволовых клеток in vivo. Трансплантация была впервые применена к изучению стволовых клеток 1 костного мозга, что способствовало установлению иерархических характеристик гемопоэтической системы 2 . В эндотелиальном поле матрица подвальной мембраны ( например, матригеля), вставленная подкожно под боковую оболочку, была стандартным анализом ангиогенеза in vivo, используемым для решения возможностей формирования сосудов трансплантированных EC. Несколько экспериментальных методов, включая образование колоний в системах 3D-культуры и трансплантации, предложили потенциальные популяции предшественников EC / VESC 3 , 4 , 5 , 6 . Однако, поскольку ИС, встроенные в матрицу фундаментальной мембраны, относительно независимы отОкружающая ткань, это не обеспечивает оптимальную нишевую среду, необходимую для полного изучения ангиогенного потенциала трансплантированных клеток. В результате сосуды, образованные внутри матричной пробки, преимущественно капиллярны и функционально неизмеримы.
Молочная железа развивается постнатально, причем наиболее устойчивый рост происходит во время полового созревания и беременности. На пубертатной стадии эпителий молочной железы подвергается быстрому расширению, занимая всю молочную жировую подушку, сопровождаемую эффективным ремоделированием окружающих сосудистых структур. Таким образом, молочная железа является отличной моделью для изучения ангиогенеза. Он обеспечивает пространственные, матричные и богатые ангиогенные стимулы от растущего эпителия молочной железы и поэтому является идеальным местом прививки для оценки ангиогенного потенциала экзогенных клеток. Кроме того, подушка для молочной железы позволяет сформированным экзогенным сосудам интегрироваться с системой циркуляции хозяина, что позволяет далее fА также представляет собой преимущество перед подкожной трансплантацией.
Хотя анализы культивирования и трансплантации di vitro являются таким же эффективным способом исследования регенерирующих свойств популяции клеток, известно, что такие анализы могут стимулировать пластичность, поскольку клетки отбираются из их родных мест обитания, и изменения могут быть вызваны, когда клетки отсоединены от Их физиологическое окружение 7 . Поэтому получение прямых in vivo доказательств клеточной судьбы является ключевым подходом к продвижению современного понимания поведения популяций эндотелия.
Генетическая картинка судьбы ( т. Е. Трассировка линии in vivo ) необходима для идентификации VESC и для исследования их свойств в системе организма, поскольку она может выявлять поведение стволовых клеток in vivo в его физиологическом контексте, а фактическая стебельность может быть оценены. Lineage traciNg дает прямые доказательства долговременной стойкости ( т.е. самообновления) кандидатов VESC и их способности производить типы клеток для ткани происхождения ( т. Е. Дифференцировочную активность).
В этом протоколе описывается новая методика трансплантации молочной жировой ткани и метод трассировки линии, чтобы наблюдать способность сосудов VESC. Эти методы преодолевают недостатки имеющихся в настоящее время анализов и обеспечивают новый способ оптимальной оценки свойств стволовых клеток VESC. Эти подходы являются эффективными инструментами, которые могут быть использованы для оценки поведения и сосудообразующих свойств популяций эндотелия, а также для определения изменения потенции сосудистых клеток в патологической среде.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ ангиогенеза представляет собой хороший экспериментальный подход к изучению сосудистой динамики. Мышь сетчатки сетчатки, которая развивается постнатально, оказалась привлекательной моделью для изучения ангиогенеза 12 . Несмотря на то, что он относительно доступен,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (31530045 и 31371500 до ЯЗ, 31401245 – QCY), Министерством науки и технологий Китая (2014CB964800), Китайской академией наук (XDB19000000 до ЯЗ) и китайской Общество клеточной биологии (Ранняя карьера для QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
Riferimenti
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
