Sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni

Sommario

Abbiamo sviluppato un metodo per eliminare, elaborare, tagliare e colorare con successo, per la valutazione istopatologica, il tessuto mammario che era stato originariamente fissato su diapositive come supporti interi. Questo metodo può promuovere la raccolta e la valutazione dei supporti integrali delle ghiandole mammarie negli studi di orientamento test riproduttivo e di sviluppo.

Abstract

Lo sviluppo della ghiandola mammaria normale può essere alterato dall'esposizione a tossiche ambientali e ai prodotti farmaceutici, esposizione eccessiva agli ormoni e alterazioni genetiche. I supporti interiori della ghiandola mammaria sono un metodo poco costoso per catturare la progressione dei cambiamenti morfologici che possono sorgere dopo l'esposizione. Tuttavia, nella vita successiva, quando le anomalie sono più inclini a svilupparsi, la sola dipendenza da questo metodo può non fornire sempre informazioni sufficienti per fare una corretta diagnosi dell'anomalia. Storicamente, negli studi di orientamento chimico della prova, una singola ghiandola mammaria viene rimossa in necrosi e preparata come una sezione ematossilina e eosina (H & E). L'incorporazione della raccolta e dell'analisi contralaterale di mammiferi integrali diminuisce la probabilità di una valutazione falsa-negativa. La valutazione dell'intero supporto è limitata dalla presenza di una o due intere ghiandole mammarie su uno scivolo e in alcuni casi le anomalie osservate nell'intero supporto non sonoT uniformemente rappresentato nella sezione H & E. L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un protocollo per la conversione di supporti interni di mammary coperti in H & E, in modo che le lesioni che altrimenti sarebbero state perdute o che sono difficili da diagnosticare possono essere identificate. Qui, abbiamo dettagliato un metodo per produrre una sezione H & E di alta qualità incorporata in paraffina da una ghiandola mammaria inizialmente preparata come supporto intero. In confronto ad un tessuto che è stato intenzionalmente preparato per la sezione H & E, l'intero supporto richiede ulteriori preparazioni per la rimozione e l'elaborazione dei tessuti. Tuttavia, questo metodo è considerato poco costoso, in quanto richiede comuni reagenti di laboratorio e poco tempo supplementare. Di conseguenza, questo metodo può fornire informazioni preziose su come le esposizioni chimiche e ambientali alterano il normale sviluppo mammario, oltre a visualizzare le modifiche che si verificano a causa di modifiche genetiche.

Introduzione

Il montascale mammario è un metodo utile e poco costoso, realizzato in molti studi su ratti e mouse, per comprendere sia lo sviluppo anomalo normale che chimico-indotto. In generale, una ghiandola mammaria raccolte a vari stadi durante lo sviluppo roditore (cioè, l'adolescenza, pubertà, metà a fine gestazione, e la fase di involuzione) mostrerà cambiamenti morfologici nel tessuto e architettura cellulare influenzato da paracrino, endocrini, e fattori autocrini ¹ . Nel ratto di invecchiamento, le porzioni epiteliali e stromali della ghiandola diventano sempre più densi, rendendo difficili i parametri morfologici di misura in un intero monte. Quindi, è pratica comune raccogliere una ghiandola per la valutazione istologica per identificare i cambiamenti a livello microscopico. Entrambi i processi sono particolarmente utili in studi che implicano esposizione chimica ( cioè ambientale o farmaceutica) o per esaminare i cambiamenti morfologici accompagnati da alterazioni genetichezioni.

Le tecniche e le capacità di utilizzare la ghiandola mammaria nella valutazione del rischio continuano ad evolversi. Mentre la preparazione a tutto montaggio è routine e standardizzata, le modifiche alla sezione continuano ^{2 , 3} . Molti gruppi di ricerca di diversi ambiti (ad esempio, università, governo e industria) hanno adattato le sezioni coronali / longitudinali del tessuto mammario come un metodo preferito, mentre alcuni laboratori utilizzano ancora sezioni trasversali attraverso la pelle ⁴ . Quest'ultimo metodo produce un'incredibile rappresentazione dell'epidermide (pelle), anziché del tessuto di interesse: l'epitelio della ghiandola mammaria ² . Le sezioni coronali o longitudinali sono più utili per caratterizzare il tessuto normale ⁵ e migliorare notevolmente la rilevazione di anomalie e lesioni dovute all'aumento della superficie e al numero di strutture presenti. Nel complesso, questo rende tutto il moUn metodo adeguato per la valutazione comparativa istopatologica della ghiandola mammaria ^{1 , 2} . Sia che si utilizzi un topo o un ratto, il recupero e conservazione del 4 ^° e 5 ^° ghiandole inguinali è altamente raccomandato per il confronto di tutta montare una sezione controlaterale H & E.

Se utilizzati in combinazione, la sezione H & E e l'intero supporto forniscono un accurato esame dei cambiamenti cellulari e morfologici indotti dall'esposizione ambientale. Ciò è particolarmente vero in alcuni ceppi di roditori in cui il modello possiede una bassa suscettibilità alla formazione del tumore o un tumore non è grossolanamente visibile. In alcune circostanze, l'ottenimento del tessuto richiesto può non essere sempre possibile utilizzando entrambe le tecniche ( ossia quantità insufficiente di tessuti, risorse o risultati sperimentali inaspettati). Nel nostro caso, anomalie sono state osservate nel montante intero mammario, mentre istopatoI risultati logici nella ghiandola H & E contralaterale erano per lo più normali. La divergenza enorme tra le ghiandole contralaterali ci ha portati a sviluppare una procedura economica ed efficiente per individuare le anomalie in tutti i montanti. Utilizzando una procedura di trasformazione e di incorporazione modificata, le sezioni trattate con H & E di alta qualità sono state preparate da supporti interamente incorporati in paraffina. Immaginiamo che questo protocollo diventi uno strumento di rilevazione potente per gli effetti di esposizione chimica, migliorando i confronti tra laboratori.

Protocollo

Tutti gli usi animali e le procedure per questo studio sono state approvate dall'animale NIEHS Laboratory

Comitato per la cura e l'uso e condotto in un'associazione per la valutazione e l'accreditamento di

Impianto accreditato per la cura degli animali da laboratorio.

1. Mammary Preparazione a tutto sesto ^{2 , 3 , 6 , 7}

1. Rimuovere le ghiandole mammarie inguinali da un lato di un mouse femminile non pregnant CD-1, come descritto nel riferimento ³ , e posizionarle su uno scivolo elettrostaticamente caricato.
2. Coprire la ghiandola con carta o pellicola antiaderente e inserire un'altra diapositiva in cima. Aggiungere la pressione ( cioè i pesi dell'acqua) alla diapositiva per spargere la ghiandola in modo che la ghiandola rimanga sullo scivolo per fissarla.
3. Immergere le diapositive in fissativo ( es. 100% etanolo, cloroformio e acido acetico glaciale in rapporto 6: 3: 1)Pernottamento a temperatura ambiente.
4. Rimuovere le ghiandole dal fissativo e lavare in etanolo per 15-30 min. Dopo il lavaggio di 30 minuti, passare gradualmente all'acqua versando 1/3 dell'etanolo e aggiungendo acqua. Lasciate che il lavaggio rimanga per circa 5 minuti ogni volta e ripeti con l'aggiunta dell'acqua 3 volte.
5. Macchiare (per esempio, soluzione aluminica di carminio) per 12-24 h.
   NOTA: I tessuti più spesso richiedono tempi di colorazione più lunghi. Vedere il riferimento ³ per la colorazione dei dettagli.
6. Versare la macchia dopo il tempo assegnato e sciacquare le diapositive in acqua per 30 s. Deidirli i tessuti lavando le vetrini in etanolo al 70% per 15 minuti, seguite da un lavaggio di 15 minuti in etanolo al 95% ed un lavaggio finale in etanolo al 100% per 20 minuti.
7. Eliminare il grasso dai tessuti, collocandoli in xilene per un minimo di 24 ore, o più a lungo se il tessuto è spesso, in modo da rimuovere tutte le aree opache o bianche.
8. Rimuovere il tessuto dal xilene e aggiungere rapidamente mMettere il medesimo al diapositiva per evitare la disidratazione dei tessuti; Posizionare un coperchio sulla parte superiore. Lasciare asciugare la diapositiva per almeno 48 ore.
9. Valutare il tessuto interamente montato per le anomalie, come descritto in ² .
   NOTA: quando le lesioni vengono rilevate in montagne intere e la sezione è necessaria per stabilire la loro identità, seguire le seguenti fasi.

2. Rimozione del Mammary Whole Mount da una diapositiva di vetro

1. Rimuovere la copertura e il supporto di montaggio sommersando la scivolata del mammifero in un recipiente di vetro colorato pieno di xilene durante la notte.
   NOTA: I tessuti e le diapositive più alte con una soluzione di montaggio eccessiva possono richiedere tempi aggiuntivi per la rimozione del coperchio.
2. Dopo il primo bagaglio di notte, posizionare le diapositive in xilene fresco e immergere per 6 ore. Effettuare un ultimo ammollo in xilene fresco durante la notte.
   NOTA: La copertura copre facilmente la diapositiva dopo l'ultima immersione.
3. Con agAmate la mano, tenete la diapositiva e rimuovete accuratamente la coperta con una coppia di pinze per assicurarne la rimozione in un solo pezzo.
   NOTA: Nel caso in cui il coperchio sia ancora fissato al vetrino, continuare a immergerlo finché non si può rimuovere con poco sforzo.
4. Una volta rimossa la copertura, tenere la diapositiva perpendicolarmente ad un piatto di vetro di Petri contenente xilene, prendete attentamente una lama di rasoio tagliente e usa e scorri la lama in un solo movimento verso il basso.
5. Una volta che il tessuto viene rimosso, immettere rapidamente il tampone mammario in un piatto di vetro Petri pieno di xilene per assicurare che il tessuto non si asciughi.
   NOTA: Attenersi a questo passaggio. L'intero supporto è sottile (≤ 1 mm) e fragile dall'elaborazione di xilene. Ogni impressione o lacrime può cambiare la morfologia del tessuto e complicare le valutazioni successive.

3. Trattamento dei tessuti

1. Una volta che il tessuto è nel piatto di Petri, trasferirlo con curaA una cassetta di istologia etichettata. Afferrare il bordo del tampone di grasso con punte a punta a punta liscia, per ridurre al minimo i danni ai tessuti.
   1. Usando un rasoio, tagliate a metà i tessuti più grandi (specialmente per i topi) e collocarli in due cassette etichettate separate che accolgono le dimensioni del tessuto. Posizionare il tessuto a destra con l'alto (utilizzare il linfonodo come riferimento). Assicurarsi che il tessuto senza il linfonodo sia mantenuto nella stessa posizione in posizione verticale quando viene trasferito nella cassetta.
2. Posizionare la cassetta in un contenitore di xilene per un massimo di 2 ore prima di collocarlo nel processore del tessuto.
   NOTA: Si raccomanda di elaborare i campioni nello stesso giorno in cui vengono collocati nella cassetta. L'imbottitura estesa in xilene non è stata testata.
3. Caricare il numero massimo di cassette nel processore del tessuto a mano.
4. Prima di iniziare, programma tutti i reagenti che verranno utilizzati per questo processo nell'elenco dei reagenti del processore. Per automatizzare il movimentoDa una stazione all'altra, utilizzare le opzioni del menu e creare un nuovo programma. Una volta completati tutti i passaggi, selezionare 'OK' per procedere.
   NOTA: Il processore consentirà la revisione di tutti i dettagli della stazione prima di avviare.
   1. Automatizzare il processore per immergere le cassette in xilene per 30 minuti a 37 ° C, seguita da una seconda immersione in xilene fresco nelle stesse condizioni. Automatizzare il processore per rimuovere le cassette dalla soluzione xilene e trasferire i tessuti nella stazione successiva contenente una miscela di paraffina fusa di 1: 1, impostata a 60 ° C, per 30 min.
      NOTA: Il processore trasferirà le cassette in una nuova camera che contiene paraffina fusa per 1 ora. Dopo 1 ora i campioni saranno automaticamente trasferiti in una nuova camera di paraffina fusa fresca e saranno trattati per altri 2 h. Entrambe le fasi vengono eseguite a 60 ° C.
   2. Il processore poi trasferisce le cassette alla stazione contenente para paraFfin per 1 h. Quindi, i campioni vengono automaticamente trasferiti alla stazione finale di paraffina fusa fresca e trattati per altri 2 h. Entrambe le fasi vengono eseguite a 60 ° C.

4. Incorporare il tessuto mammario lavorato

1. Posizionare le cassette nel serbatoio della paraffina 58 ° C della stazione di incorporazione fino a quando non sarà pronto per incorporare il tessuto nello stampo.
2. Rimuovere il coperchio della cassetta per determinare la migliore dimensione dello stampo per il tessuto. Assicurarsi che lo stampo sia abbastanza grande per accogliere il tessuto e lasciare abbastanza spazio per avere un bordo di paraffina privo di tessuti attorno al perimetro.
3. Aggiungere 3-4 mm di paraffina fusa allo stampo e orientare la superficie del mammifero interamente montata, che era adiacente al fondo della vetretta di vetro e al fondo della cassetta, rivolta verso l'alto nello stampo.
4. Trasferire lo stampo su una piastra di raffreddamento e regolare rapidamente il tessuto secondo necessità in modo che sia parallelo allo stampo bottom.
   NOTA: Una volta che la paraffina si indurisce, il tessuto verrà bloccato in posizione.
5. Usando le pinze calde, posizionare la metà inferiore della cassetta sulla parte superiore dello stampo; Premere saldamente con la pinza.
6. Aggiungere una ulteriore paraffina fusa allo stampo in un movimento continuo per coprire l'intera cassetta. Spostare lo stampo dalla piastra calda a una piastra fredda per completare l'indurimento del blocco.
7. Rimuovere il blocco dallo stampo quando la paraffina si solidifica completamente per evitare crepe o bolle d'aria.
   NOTA: Conservare i tessuti incorporati in paraffina a temperatura ambiente fino a quando non è pronto per la sezione.

5. Sezione del tessuto mammario incorporato in paraffina sul microtomo

1. Prima della sezionatura, incubare i blocchi di paraffina a -20 ° C per 1 h.
   NOTA: Ci sarà un supporto di montaggio residuo nel blocco dal tessuto originale completo di copertina. Il raffreddamento del blocco migliora la sezione di blocco e il nastro.
2. Preparare il microfonoGirare accendendo il bagno d'acqua, contenente acqua fresca distillata e regolare la temperatura a 42-45 ° C. Posizionare una lama fresca a basso profilo sul microtomo e impostarla a 4 μm.
   NOTA: La qualità della sezione viene ridotta con sezioni più spesse di 4 μm a causa della presenza di un supporto di montaggio residuo nel tessuto.
3. Inserire il blocco nel microtomo con la cera rivolta verso la lama e allineare al piano verticale. Quindi, inumidire una sezione di rilievo in acqua fredda e metterlo sul blocco per alcuni minuti.
4. Sezione il blocco ruotando la ruota grande in un movimento in senso orario, in combinazione con la ruota avanzata avanzata, fino a ottenere una faccia piena o una sezione rappresentativa del blocco.
   NOTA: Il tessuto è sottile a causa della radura di xilene durante il processo di montaggio. Allineare correttamente il blocco con la lama per ridurre al minimo il numero di tagli per ottenere una sezione rappresentativa.
5. Scegli il nastroSpostare con attenzione il nastro nel bagno d'acqua caldo (45 ° C) preparato in anticipo, consentire alle rughe dei tessuti di dissipare e galleggiano con cura un tratto su una lastra di vetro pulita.
6. Posizionare le diapositive verticalmente su un rack per asciugare per rimuovere l'acqua in eccesso. Incubare le diapositive in una scivoletta leggermente aperta per una notte a 37 ° C.

6. H & E automatizzata e manuale di colorazione dei tessuti mammari sezionati

1. Prima della colorazione, le diapositive vengono conservate a temperatura ambiente.
2. Per la colorazione automatica, selezionare H & E dalle opzioni di colorazione nel menu principale. La deparaffinazione, la colorazione e la disidratazione sono tutti completati sul macchinario automatizzato. Utilizzare un supporto di montaggio e una copertura per montare le sezioni.
3. Se si colorano manualmente le diapositive, deparaffinare le sezioni immersando le diapositive in xilene per 5 min. Trasferire in xilene fresco e ripetere per 5 minuti.
4. Riabilita le diapositive immersing thEm due volte in etanolo al 100% per 3 minuti ciascuno, seguiti da due ripetizioni in etanolo fresco al 95% e due lavaggi separati in tampone di lavaggio 1X a 5 minuti ciascuno.
5. Sciacquare le diapositive in acqua distillata.
6. Aggiungere le diapositive all'ematossilina per 1-2 minuti. Rimuovere le diapositive e sciacquarle con acqua corrente per 5 minuti.
   NOTA: filtrare l'ematoxilina prima di ogni utilizzo.
7. Posizionare le diapositive nell'acido acetico glaciale del 1% per 30 secondi per favorire la differenziazione del colore e poi sciacquare nell'acqua di rubinetto corrente per 1 minuto.
8. Aggiungere le diapositive a 1X PBS per 30 secondi fino a 1 min in blu le sezioni del tessuto, seguite da un risciacquo di 5 minuti in acqua di rubinetto e poi in alcool al 95% per 15-20 sec.
9. Conteggio con soluzione eosina da 30 a 1 min. Successivamente, disidratare le diapositive due volte nell'etichetta fresca del 95%, seguita da due ripetizioni fresche in etanolo al 100%. Eseguire ogni lavaggio per 5 minuti.
10. Cancella le diapositive in xilene, con due cambiamenti in xilene per 5 minuti ciascuno.
11. CoverslipLa sezione tissutale con supporto di montaggio e asciugare piano a notte a temperatura ambiente.

Risultati

Questo metodo è efficace nell'assistere le diagnosi che altrimenti potrebbero essere perse se l'originale sezione H & E del tampone mammario non ha mostrato alcun cambiamento istologico. Tuttavia, l'esito sarà utile solo se si prende cura durante la preparazione iniziale a tutto tondo, come pure durante la preparazione del tessuto per la valutazione istologica. L'incorporazione di paraffina fornirà protezione e contribuirà a preservare il tessuto per future sezioni. <...

Discussione

Il supporto integrale della ghiandola mammaria è un potente strumento che può essere utilizzato per illustrare lo sviluppo normale del mammifero e le alterazioni morfologiche che possono sorgere e persistono dopo l'esposizione a sostanze chimiche, inclusi i disgregatori endocrini. Quando un insieme completo e la sezione H & E dello stesso animale vengono valutati insieme, possono fornire un'istantanea precisa di alterazioni precoci, che possono avanzare in uno stato più malato.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Xilene	Sigma-Aldrich	214736
Permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-100	supporti di montaggio per il montaggio di montature intere e H&
Processore automatizzato Leica	Biosystems Modello	# ST5020
HM 355S Microtomo automatico	Thermo Fisher Scientific	905200
Paraffina	Leica Biosystems	EM-400
Superfrost plus vetrini per microscopio	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	caricato elettrostaticamente
Fisher Finest 24x60x1	Thermo Fisher Scientific	12-548-5P	vetrini coprioggetti
Varistain Gemini ES Coloratore automatico per vetrini	Thermo Fisher Scientific	A78000014
Sta-On	Leica Biosystems	3803107	adesivo liquido; utilizzato a bagnomaria durante il sezionamento
Ematossilina Harris modificata 72711	Richard-Allan Scientific (parte di Thermo Scientific)	72711
Eosin	Leica Biosystems	3801600
Carbonato di litio	SkyTech Laboratories	LCQ500
Acido acetico glaciale	Thermo Fisher Scientific	A38-500	necessario nel fissativo di Carnoy
Cloroformio	Macron Fine Chemicals	4440-04	necessario nel fissativo di Carnoy
100% Etanolo	The Warner Graham Company	6505001050000	necessario nel fissativo di Carnoy e vetrini di lavaggio
95% Etanolo	The Warner Graham Company	6505011137320190
Carmine Alum	Sigma-Aldrich	C1022-25G
Solfato di alluminio e potassio dodecaidrato, Sigma Ultra	Sigma-Aldrich	A7210-500G
Tampone di lavaggio per automazione, 20X	Biocare Medical	TWB945