Bewertung der sarkoplasmatischen Retikulum Calcium Reserve und intrazellulären diastolische Calcium Entfernung in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten

Summary

Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur sarkoplasmatischen Retikulum Ca^{2 +} Reserve und diastolische Kalzium-Removal-Funktion in Herzmuskelzellen durch ein Calcium imaging-System zu bewerten.

Abstract

Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Kardiale sarkoplasmatischen Retikulum (SR) dient als Ca^{2 +} Reservoir für Kontraktion, welche Reuptakes intrazellulären Ca^{2 +} während der Entspannung. Die SR Ca^{2 +} Reserve für Beats ist determinate für kardiale Kontraktilität, und die Entfernung von intrazellulären Ca^{2 +} ist entscheidend für die diastolische Herzfunktion. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen wie Diabetes und Herzinsuffizienz können den Fortschritt der kardialen Dysfunktion beeinträchtigt Kalzium Clearance und SR Ca^{2 +} Shop in Kardiomyozyten beteiligt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur SRCa^{2 +} Reserve und diastolische Ca^{2 +} Entfernung zu bewerten. Kurz, eine einzelne Cardiomyocyte wurde enzymatisch isoliert, und die intrazelluläre Ca^{2 +} Fluoreszenz von Fura-2 angegeben wurde von einem Kalzium-imaging-System aufgezeichnet. Um Koffein zur Induktion SR Ca^{2 +} Gesamtfreigabe beschäftigen, preset wir eine automatische Perfusion Schalter Programm durch Vernetzung der Stimulation und die Perfusion System. Dann wurde die Mono-exponentielle Kurvenanpassung für die Analyse von Verfall Zeitkonstanten von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse verwendet. Entsprechend der Beitrag des SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) und Na⁺-Ca^{2 +} Wärmetauscher (NCX) diastolischen Kalzium Entfernung wurde ausgewertet.

Introduction

Intrazellulären Calcium recycling ([Ca^{2 +}]_ich) spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Kardiomyozyten¹. Wie wir wissen, initiiert die Kalzium-induzierte Ca^{2 +} Freigabe der Erregung-Kontraktion Kupplung, die übersetzen des elektrischen Signals zur Kontraktion. Membran-Depolarisation aktiviert die sarcolemmal L-Typ Ca^{2 +} -Kanäle, die Ca^{2 +} induzieren von SR in das Zytoplasma über Ryanodin-Rezeptoren 2 (RyR2) zu befreien. Die vorübergehende erhöhte zytoplasmatischen Ca^{2 +} initiiert Kontraktion der Myofibrillen. Während der Diastole zytoplasmatischen Ca^{2 +} ist Reuptaken in der SR durch die SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) und pumpte aus der Cardiomyocyte über die Na⁺-Ca^{2 +} Wärmetauscher (NCX)². Dieser Prozess führt zur Kontraktion-Entspannung-recycling in der Cardiomyocyte.

Die kardiale SR ist ein intrazellulären Membran-Netzwerk, die die kontraktile Maschinen umgibt. Es dient als Ca^{2 +} Reservoir für Kontraktion, und es nimmt intrazellulären Ca^{2 +} während der Entspannung. Die SR Ca^{2 +} Reserve für Beats ist bestimmt für kardiale Kontraktilität. Unterdessen ist die Entfernung der intrazellulären Ca^{2 +} für kardiale Diastole von entscheidender Bedeutung. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen kann wie Diabetes und Herzinsuffizienz, eingeschränkter Ca^{2 +} Abstand und deprimiert SR Ca^{2 +} Shop in Herzmuskelzellen in den Prozess der kardialen Dysfunktion^{2,3 mit einbezogen werden ,4}.

Zur Messung der SR Ca^{2 +} Release und diastolische Ca^{2 +} Entfernung in Kardiomyozyten, gibt es zwei weit verbreitete Ansätze: die Integrität des aktuellen NCX basierend auf Patch-Clamp^5,6, und die Koffein-induzierte Ca ^{2 +} Puls basierend auf Ca^{2 +} Fluoreszenz imaging^7,8,9. Das erste Verfahren hängt davon ab, dass die Ca^{2 +} SR befreit weitgehend aus der Zelle durch NCX gepumpt wird. Allerdings ist dieser Ansatz von seiner Forderung nach vorgerückte Ausrüstung und geschickte Betrieb begrenzt. In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine bequeme Herangehensweise zur SR Ca^{2 +} Reserve und Ca^{2 +} Entfernung in Myozyten Beurteilung durch die Messung eines Koffein-induzierte Ca^{2 +} Puls basiert auf einem Ca^{2 +} Fluoreszenz imaging System. Kurz, wird die intrazelluläre Ca^{2 +} Fluoreszenz durch Fura-2. Durch Vernetzung der Stimulation und Durchblutung System, präsentieren wir Ihnen ein Programm zur Umstellung der Perfusion und Tempo System automatisch. 10 mM Koffein wurde eingesetzt, um schnell total Ca^{2 +} Release in der SR induzieren Der exponentiellen Zerfall Zeitkonstante (Tau) von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse wurden von Mono-exponentielle Kurvenanpassung, erhalten, die den Beitrag der SERCA und NCX, diastolische Ca^{2 +} Entfernung entsprechend widerspiegeln.

Protocol

alle Tierversuche durchgeführt gemäß Protokollen durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences und Zhejiang University genehmigt. 1. Vorbereitung der Lösung bereiten Sie alle Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben. 2. Isolation des linken Ventricular (LV) Kardiomyozyten Hinweis: LV Kardiomyozyten sind isoliert enzym…

Representative Results

Wir zeigen hier, Streptozocin (STZ) – induzierte diabetische Ratten (DM) und Alter abgestimmten Sprague – Dawley (SD) Ratten zum Beispiel. 8 Wochen alten männliche SD-Ratten (200 ± 20 g) erhielt eine einmalige intraperitoneale Injektion von STZ (70 mg/kg, Ip) für den DM-Gruppe oder Citrat-Puffer für die Kontrollgruppe. Eine Woche nach STZ Verwaltung, Ratten mit Blutzucker > 16,7 Mmol/L wurden als Diabetiker. Nach 8 Wochen wurden die LV Myozyten enzymatisch isoliert. Nach Kalzium W…

Discussion

Kalzium-Flussmittel befreit die SR ist Ca^{2 +} Hauptquelle für Systole im Herzen. Teilweise, die Amplitude der SR Ca^{2 +} Content und die gebrochene Ca reflektieren^{2 +} SR befreit die SR Ca^{2 +} Reserve für kardiale Kontraktion zur Verfügung. Auf der anderen Seite hängt die Ca^{2 +} Reserve von SR von der Fähigkeit der SR Ca^{2 +} Reuptake, Ca^{2 +} Leck von SR und ihr Gleichgewicht über die SR während der Diastole^12,<s…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436