Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur sarkoplasmatischen Retikulum Ca2 + Reserve und diastolische Kalzium-Removal-Funktion in Herzmuskelzellen durch ein Calcium imaging-System zu bewerten.
Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Kardiale sarkoplasmatischen Retikulum (SR) dient als Ca2 + Reservoir für Kontraktion, welche Reuptakes intrazellulären Ca2 + während der Entspannung. Die SR Ca2 + Reserve für Beats ist determinate für kardiale Kontraktilität, und die Entfernung von intrazellulären Ca2 + ist entscheidend für die diastolische Herzfunktion. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen wie Diabetes und Herzinsuffizienz können den Fortschritt der kardialen Dysfunktion beeinträchtigt Kalzium Clearance und SR Ca2 + Shop in Kardiomyozyten beteiligt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur SRCa2 + Reserve und diastolische Ca2 + Entfernung zu bewerten. Kurz, eine einzelne Cardiomyocyte wurde enzymatisch isoliert, und die intrazelluläre Ca2 + Fluoreszenz von Fura-2 angegeben wurde von einem Kalzium-imaging-System aufgezeichnet. Um Koffein zur Induktion SR Ca2 + Gesamtfreigabe beschäftigen, preset wir eine automatische Perfusion Schalter Programm durch Vernetzung der Stimulation und die Perfusion System. Dann wurde die Mono-exponentielle Kurvenanpassung für die Analyse von Verfall Zeitkonstanten von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse verwendet. Entsprechend der Beitrag des SR Ca2 +-ATPase (SERCA) und Na+-Ca2 + Wärmetauscher (NCX) diastolischen Kalzium Entfernung wurde ausgewertet.
Intrazellulären Calcium recycling ([Ca2 +]ich) spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Kardiomyozyten1. Wie wir wissen, initiiert die Kalzium-induzierte Ca2 + Freigabe der Erregung-Kontraktion Kupplung, die übersetzen des elektrischen Signals zur Kontraktion. Membran-Depolarisation aktiviert die sarcolemmal L-Typ Ca2 + -Kanäle, die Ca2 + induzieren von SR in das Zytoplasma über Ryanodin-Rezeptoren 2 (RyR2) zu befreien. Die vorübergehende erhöhte zytoplasmatischen Ca2 + initiiert Kontraktion der Myofibrillen. Während der Diastole zytoplasmatischen Ca2 + ist Reuptaken in der SR durch die SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) und pumpte aus der Cardiomyocyte über die Na+-Ca2 + Wärmetauscher (NCX)2. Dieser Prozess führt zur Kontraktion-Entspannung-recycling in der Cardiomyocyte.
Die kardiale SR ist ein intrazellulären Membran-Netzwerk, die die kontraktile Maschinen umgibt. Es dient als Ca2 + Reservoir für Kontraktion, und es nimmt intrazellulären Ca2 + während der Entspannung. Die SR Ca2 + Reserve für Beats ist bestimmt für kardiale Kontraktilität. Unterdessen ist die Entfernung der intrazellulären Ca2 + für kardiale Diastole von entscheidender Bedeutung. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen kann wie Diabetes und Herzinsuffizienz, eingeschränkter Ca2 + Abstand und deprimiert SR Ca2 + Shop in Herzmuskelzellen in den Prozess der kardialen Dysfunktion2,3 mit einbezogen werden ,4.
Zur Messung der SR Ca2 + Release und diastolische Ca2 + Entfernung in Kardiomyozyten, gibt es zwei weit verbreitete Ansätze: die Integrität des aktuellen NCX basierend auf Patch-Clamp5,6, und die Koffein-induzierte Ca 2 + Puls basierend auf Ca2 + Fluoreszenz imaging7,8,9. Das erste Verfahren hängt davon ab, dass die Ca2 + SR befreit weitgehend aus der Zelle durch NCX gepumpt wird. Allerdings ist dieser Ansatz von seiner Forderung nach vorgerückte Ausrüstung und geschickte Betrieb begrenzt. In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine bequeme Herangehensweise zur SR Ca2 + Reserve und Ca2 + Entfernung in Myozyten Beurteilung durch die Messung eines Koffein-induzierte Ca2 + Puls basiert auf einem Ca2 + Fluoreszenz imaging System. Kurz, wird die intrazelluläre Ca2 + Fluoreszenz durch Fura-2. Durch Vernetzung der Stimulation und Durchblutung System, präsentieren wir Ihnen ein Programm zur Umstellung der Perfusion und Tempo System automatisch. 10 mM Koffein wurde eingesetzt, um schnell total Ca2 + Release in der SR induzieren Der exponentiellen Zerfall Zeitkonstante (Tau) von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse wurden von Mono-exponentielle Kurvenanpassung, erhalten, die den Beitrag der SERCA und NCX, diastolische Ca2 + Entfernung entsprechend widerspiegeln.
Kalzium-Flussmittel befreit die SR ist Ca2 + Hauptquelle für Systole im Herzen. Teilweise, die Amplitude der SR Ca2 + Content und die gebrochene Ca reflektieren2 + SR befreit die SR Ca2 + Reserve für kardiale Kontraktion zur Verfügung. Auf der anderen Seite hängt die Ca2 + Reserve von SR von der Fähigkeit der SR Ca2 + Reuptake, Ca2 + Leck von SR und ihr Gleichgewicht über die SR während der Diastole12,<s…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), der Medizin und Gesundheit Wissenschaft Programm der Provinz Zhejiang (Nr. 201646246, Dongwu Lai) und der Gesundheitswissenschaften und Technologie-Plan der Stadt Hangzhou (Nr. 2013A28, Ding Lin).
NaCl | Alfa Aesar | E31K43 | |
MgCl2 | Alfa Aesar | I02T070 | |
KCl | Alfa Aesar | G22u018 | |
HEPEs | Sigma | SLBM 7880V | |
D-Glucose | Alfa Aesar | 10189341 | |
NaOH | Alfa Aesar | 10154048 | |
KOH | Alfa Aesar | 10144B17 | |
KH2PO4 | Alfa Aesar | F21S033 | |
MgSO4 | Alfa Aesar | C31U038 | |
L-Glutamic | Alfa Aesar | 10149849 | |
Taurine | Alfa Aesar | J5407a | |
EGTA | Sigma | SLBM6826V | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Collagenase Type II | Worthington | 45k16005 | |
BSA | Roche | 735094 | |
caffeine | Sigma | C0750 | |
Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |