Valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati

Summary

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione del reticolo sarcoplasmico Ca^{2 +} riserva e funzione di rimozione del calcio diastolica in cardiomiociti da un sistema di imaging di calcio.

Abstract

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Cardiaco reticolo sarcoplasmatico (SR) funge da Ca^{2 +} serbatoio per contrazione, che reuptakes intracellulare Ca^{2 +} durante il rilassamento. La SR Ca^{2 +} riserva disponibile per beats è determinata per contractibility cardiaco, e la rimozione di intracellulare di Ca^{2 +} è critica per la funzione cardiaca diastolica. In alcune condizioni fisiopatologiche, come il diabete e infarto, alterato del calcio liquidazione e SR Ca^{2 +} store nei cardiomyocytes possono essere coinvolti nel progresso della disfunzione cardiaca. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione SRCa^{2 +} riserva e diastolica Ca^{2 +} rimozione. Brevemente, un singolo dei cardiomiociti era enzimaticamente isolato, e l’intracellulare Ca^{2 +} fluorescenza indicata da Fura-2 è stata registrata da un sistema di imaging del calcio. Per assumere caffeina per indurre il rilascio totale di SR Ca^{2 +} , abbiamo preimpostato un programma di interruttore automatico di aspersione di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione. Quindi, l’adattamento delle curve mono-esponenziale è stato utilizzato per analizzare le costanti di tempo di decadimento di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina. Di conseguenza, il contributo del SR Ca^{2 +}-ATPasi (SERCA) e Na⁺-Ca^{2 +} scambiatore (NCX) alla rimozione del calcio diastolica è stato valutato.

Introduction

Calcio intracellulare ([Ca^{2 +}]_i) riciclaggio svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti¹. Come sappiamo, il calcio Ca^{2 +} rilascio indotto avvia l’accoppiamento, di eccitazione-contrazione che traducono il segnale elettrico alla contrazione. La depolarizzazione della membrana attiva il sarcolemma Ca L-tipo^{2 +} canali, che inducono il Ca^{2 +} rilasciano da SR nel citoplasma attraverso recettori della rianodina 2 (RyR2). I transitori elevati citoplasmico Ca^{2 +} avvia la contrazione delle miofibrille. Durante la diastole, citoplasmici Ca^{2 +} è reuptaken nel SR per mezzo di SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) e pompato fuori del cardiomyocyte via Na⁺-Ca^{2 +} scambiatore (NCX)². Questo processo conduce alla contrazione-rilassamento riciclaggio nei cardiomiociti.

Il SR cardiaco è una rete di intracellulare della membrana che circonda il macchinario contrattile. Esso funge da Ca^{2 +} serbatoio per la contrazione, e riassorbe intracellulare di Ca^{2 +} durante il rilassamento. La SR Ca^{2 +} riserva disponibile per beats è determinata per la contrattilità cardiaca. Nel frattempo, la rimozione di intracellulare di Ca^{2 +} è critica per la diastole cardiaca. In alcune condizioni fisiopatologiche, come diabete e infarto, distanza^{2 +} Ca alterata e depresso SR Ca^{2 +} negozio in cardiomiociti può essere coinvolti nel processo di disfunzione cardiaca^{2,3 ,4}.

Per misurare il rilascio di SR Ca^{2 +} e Ca^{2 +} rimozione diastolica in cardiomiociti, esistono due approcci ampiamente usati: l’integrità della corrente NCX basato su patch clamp^5,6e la Ca indotta da caffeina ^{2 +} pulse basato su Ca^{2 +} fluorescenza imaging^7,8,9. Il primo approccio dipende dal fatto che il Ca^{2 +} rilasciato dal SR è in gran parte pompato fuori dalla cella di NCX. Tuttavia, questo approccio è limitato dalla sua esigenza di attrezzature avanzate e abile operazione. Nello studio presente, descriviamo un metodo conveniente per valutare la riserva di SR Ca^{2 +} e Ca^{2 +} rimozione nei miociti misurando un indotta da caffeina Ca^{2 +} impulso basato su un Ca^{2 +} fluorescenza sistema di imaging. Brevemente,^{intracellulare Ca 2 +} la fluorescenza è indicata da Fura-2. Di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione, vi presentiamo un programma per la perfusione di commutazione e automaticamente il sistema di stimolazione. 10 millimetri di caffeina è stata impiegata per indurre rapidamente il totale Ca^{2 +} rilascio in SR. Le costanti di tempo di decadimento esponenziale (Tau) di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina sono state ottenute da mono-esponenziale curva di raccordo, che riflettono la contribuiscono di SERCA e NCX alla diastolica Ca^{2 +} rimozione di conseguenza.

Protocol

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato di uso presso centro di ricerca sperimentale, Accademia delle scienze mediche cinese Cina e Università di Zhejiang e istituzionali Animal Care. 1. preparazione della soluzione preparare tutte le soluzioni, come descritto nella tabella 1. 2. isolamento di sinistra ventricolare (LV) cardiomiociti Nota: LV car…

Representative Results

Qui, vi illustriamo streptozotocin (STZ) – ratti diabetici (DM) indotti e pari età Sprague – Dawley (SD) ad esempio i ratti. 8-settimana-vecchio maschio SD ratti (200 ± 20 g) hanno ricevuto una singola iniezione intraperitoneale di STZ (70 mg/kg, ip) per il buffer di gruppo o citrato di DM per il gruppo di controllo. Una settimana dopo amministrazione di STZ, ratti con glicemia > 16.7 mmol/L sono stati considerati diabetici. Dopo 8 settimane, i miociti di LV sono stati enzimaticamen…

Discussion

Flusso di calcio rilasciato dal SR è il Ca^{2 +} fonte principale per sistole nel cuore. A una certa misura, l’ampiezza del SR Ca^{2 +} contenuto e frazionario Ca^{2 +} rilasciato dal SR riflettono la SR Ca^{2 +} riserva disponibile per la contrazione cardiaca. D’altra parte, il Ca^{2 +} riserva di SR dipende dalla capacità del loro equilibrio, Ca^{2 +} perdita di SR e SR Ca^{2 +} reuptake attraverso la SR durante la diastole^12,<…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436