생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발
Summary
여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.
Abstract
많은 in vitro 질병 모델이 hiPSCs를 사용하여 개발되었지만, 한 가지 제한점은 이러한 2 차원 (2-D) 시스템이 의심되는 질병 변이를 가진 감염된 개인의 기본 세포질 및 기능적 복잡성을 나타내지 않을 수 있다는 것입니다. 기존의 2D 모델은 생체 내 유사 구조의 불완전한 표현으로 남아 있으며 뇌의 복잡성을 적절히 포착하지 못합니다. 따라서, 생체 내 시스템 에서 보이는 세포 상호 작용 및 기능을보다 잘 나타낼 수있는 3-D hiPSC- 기반 모델에 대한 필요성이 대두되고있다.
여기서는 무 혈청 배아 체 (SFEB)에 기초한 미분화 된 hiPSCs로부터 3-D 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고한다. 이 3-D 모델은 발달중인 신피질의 양상을 반영하고, 이동하는 신경 세포 및 이동성, 연결성, 통신 및 매트와 같은 손상되지 않은 조직에 필수적인 기능에 대한 연구를 허용합니다uration. 특히 우리는 우리의 프로토콜을 사용하는 SFEB가 칼슘 이미징과 같은 생리 학적으로 관련성이 높은 고농축 세포 기반 분석법 및 cryosectioning없는 다중 전극 배열 (MEA) 기록을 사용하여 조사 될 수 있음을 입증합니다. MEA 기록의 경우, 우리는 SFEB가 장기간 배양하는 동안 스파이크 활동과 네트워크 수준 파열 활동을 증가 시킨다는 것을 입증합니다. 이 SFEB 프로토콜은 초기 대뇌 피질 발달의 양상을 포착하는 3-D 모델에서 네트워크 형성을 개발하는 연구를위한 견고하고 확장 가능한 시스템을 제공합니다.
Introduction
우리는 이전에 초기 대뇌 피질의 네트워크 개발 1의 일부 측면을 되풀이되었습니다 환자 유래 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 생성 된 3-D 모델 시스템을보고했다. 혈청없는 배아 체 (SFEB) 인이 3-D 모델은 이전의 단순 응집 hiPSC 모델 2 , 3을 향상시킵니다. 우리의 SFEB와 같은 3D 구조가 2 차원 (2-D) / 단일 층 hiPSC 모델 4 , 5 에서 관찰 된 것보다 더 일찍 생체 내 에서 관찰 된 신경 발달의 대략적인 양상을 드러내고있다. 초기 연구는 생리 학적 복잡성을 입증하지 않고 3 차원 신체의 자기 조직화 복잡성에 초점을 두었습니다 2 .
여기에 설명 된 프로토콜은 섬유 아세포에서 유래 undifferentiated hiPSCs에 사용되었습니다 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC). 이 세포는 γ 선발 마우스 배아 기 (MEFs)에서 유지됩니다. 이러한 hiPSC 콜로니를 자발적으로 분화 된 세포에서 수동으로 세척하고, 효소 적으로 수확하고, Rho 키나제 억제제 Y-27632 (ROCKi)를 함유하는 배지에 재현 탁한다. 미분화 hiPSC는 96 웰 저 접착 V 바닥 플레이트로 옮기기 전에 해리 및 원심 분리를 거친다. 도금 후, 앞쪽 전두엽의 뇌신경 – 운명 계통 6 을 구동하기 위해 이중 SMAD 억제 (dickkopf 1 (DKK-1)와 함께 SB431542 및 LDN193189)를 사용하여 신경 유도를 개시한다. 14 일 후, SFEB는 6- 웰 플레이트의 세포 배양 삽입물로 옮겨진다. 전달 된 라운드 SFEBs는 유사한 세포 배양 삽입물 1 , 2 , 3을 사용하여 해마 기관 체적 슬라이스 배양 조제 물에서 종종 관찰되는 바와 같이 국부적 인 네트워크 연결을 유지하면서 퍼지고 얇아지기 시작한다 .ss = "xref"> 7.
이 형식의 SFEB 기반 3-D 플랫폼의 사용은 단일 세포 기록 또는 다중 전극 배열 (MEA)과 같은 칼슘 이미징 또는 전기 생리 학적 분석과 같은 세포 기반 생리 학적 분석을 사용하여 조사 할 수있는 대뇌 피질 네트워크의 효율적 생산에 적합합니다 ) 1 . 3-D 시스템이 초기 피질 발달 지표를 지니고 있지만, 다른 연구들에 의하면 이러한 3-D 몸체는 본질적으로 인간 조직 발달 속도가 느려지도록 더 긴 배양 시간을 필요로 할 수 있습니다 8 . 이 SFEB 프로토콜은 피질의 초기 발달 양상을 파악하는 미분화 된 hiPSC로부터 3 차원 SFEB를 성공적으로 생성합니다.
SFEB가 신경계 장애에서 네트워크 수차를 모델링 할 수있는 가능성은이 시스템의 강점입니다. 환자 조직으로부터 유래 된 hiPSCs는 엉덩이에 영향을받는 신경계의 세포로 성장할 수있다세포 생물학뿐만 아니라 수반되는 유전자 발현과 관련이있다. 인간 iPSCs은 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD), 정신 분열증 9 레트 증후군 (10), 및 알츠하이머 병 (11), (12) 복소 병인으로 신경계 장애를 변화와 개인의 큰 그룹의 유전 적 프로파일을 확인하기 위해 사용되고있다. 최근까지 iPSC 모델은 전형적으로 분자 상호 작용을 평가하는 데 능숙한 반면 생체 내에서 관찰 되는 복잡한 세포 상호 작용을 해독하는 데는 부적합한 단일 층 준비물이었습니다. 동물 모델은 전체 기관 플랫폼을 재생성하기위한 기본 대체품이었습니다. 이 동물 모델은 결과의 빈약 한 번역에 의해 괴롭혀지고, 대규모 유전 스크리닝 연구에 의해 확인 된 인간 유전 프로파일을 복제하는 능력이 제한되어있다. 따라서, iPSC로부터 3-D 시스템을 개발하면 인간에게 필요한 복잡성 계층이 추가됩니다질병 모델링 13 , 14 . 3D hiPSC 플랫폼 다음 단계는 세포 기반 분석법을 이용하여 스크리닝 15 처리량의 큰 규모의 요구 사항을 수용하기위한 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 hiPSC 소스를 정면 피질의 초기 발달 단계를 반복하는 3 차원 구조로 차별화하기위한 조건을 제공합니다. 이 절차는 전기 생리학에 대해 조사 할 수있는 구조를 만들어내는 동시에 현미경 검사를 받아 들일 수 있습니다. SFEB의 최종 형태는 organotypic 두뇌 슬라이스 문화의 그것과 유사하고 고품질의 상세한 공 촛점 이미징을 허용합니다. 이 프로토콜은 fibroblast 및 말초 혈?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기사를 교정 해 주신 Elizabeth Benevides에게 감사드립니다. 우리는 Drs. John Hussman과 Gene Blatt가 도움이되는 토론과 의견을 전했습니다.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
Riferimenti
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