לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר דגימה לא פולשנית של דרכי הנשימה העליונות ללא הפרעה של שורות mucosal נוזל. זה גם פרטי ההליך החילוץ השתמשו לפני הניתוח של מתווכים חיסוניים בתוך נוזל eluates לצורך המחקר של דרכי הנשימה אקטואלי המערכת החיסונית החתימה, ללא צורך נהלים גירוי (משמש לעתים קרובות על ידי טכניקות אחרות). הנוזל שורות mucosal נדגמים רצועת נייר סינון הממוקמת בחלקו הקדמי של נחותים turbinate ושמאלה למשך 2 דקות הספיגה. Analytes הם eluted מהעיתון מסנן, eluates חלבון מבוססת שחולצו הם נותחו על ידי חומרים מבוסס electrochemiluminescence, המאפשר כימות רגישות גבוהה של level נמוך וגבוה analytes במדגם זהה. מדדנו את רמות ויוו 20 מתווכים חיסוניים שנבחרו מראש הקשורים ספציפית החיסונית איתות המסלולים ב רירית דרכי הנשימה העליונות, אבל הטכניקה אינה מוגבלת זה לוח ספציפי או דגימה באתר. השיטה יושמה לראשונה אצל ילדים בת 7-ממחקרים פוטנציאליים קופנהגן על אסטמה במדגם2000 (COPSAC2000) ילדות עם קדחת השחת. הוא שימש לאחר מכן במדגם האורך COPSAC2010 לידה, שנדגמו 1 חודש, 2 שנים ולאחר 6 שנים של גיל ועל מופעים של תסמינים נשימתיים חריפה. אנחנו בהצלחה שהושג וניתח דגימות 620 (89%) של 700 ילדים בן חודש 1; כמה דוגמאות היו מתחת לגבול זיהוי assay (המדווח החציון (הבין-הרביעון טווח (IQR)). מספר דוגמאות מתחת לגבול זיהוי (כלומר מ-0 עד כדי להגדיר עבור הגבול התחתון של זיהוי) עבור כל מתווך היה 29 (7.25-119.5). טכניקה זו מאפשרת כימות של vivo בתוך דרכי הנשימה הרירית המערכת החיסונית הפרופיל מלידה, יכול להיות מיושם longitudinally, שניתן להחיל על מחקרים על ההשפעה של גנטיקה, חשיפות סביבתיות-ונערותו פתופיזיולוגיה, endotyping, ניטור של מחלות נשימה, ועל פיתוח והערכה של הריפוי.
Introduction
הנוזל שורות mucosal של האף מפצה את החלק הנוזלי של מערכת הנשימה העליונה. זה מורכב של מטריצה מורכבת של מגשרים נגזר הגומלין בין האפיתל תאים חיסוניים המרכיבות את השורה הראשונה של הגנה מפני פולשים מיקרואורגניזמים. רירית האף הינו נגיש בקלות, ויש קשר פונקציונלי ו חזק בין האף של הסמפונות1. את התא הוא בעל עניין מיוחד ביחס למחלות דרכי הנשימה נפוצות בילדות, כגון אסטמה, קדחת השחת, אלא גם למגוון הפרעות נשימה אחרות נפוץ יותר מאוחר יותר בחיים.
כאן, אנו מתארים יישום שיטה מדגם ללא הפרעה הרירית רירית נוזל מתוך חלל האף באמצעות טכניקה המבוססת על נייר סינון, לא פולשנית, וכן הליך מיצוי הבאים, נהגה elute חלבון מבוססת analytes מהעיתונים סינון לפני כימות שלהם. טכניקה זו, לדוגמה, ניתן להשיג ויוו המערכת החיסונית חתימות של אנשים בריאים וגם אנשים עם מחלות נשימה שונות. יתר על כן, קיימת אפשרות לבחון חשיפות חשיבות עבור חתימה המערכת החיסונית ספציפיים וכן להעריך אם זה כמנבא או מתווך של התפתחות המחלה מאוחר יותר.
שורות mucosal נוזל שהושגו בעבר על ידי שטיפה של חלל האף2, אשר לעיתים קרובות לפניו מבחן אתגר האף, איפה אלרגן הוא הציג ברמות גבוהות כדי לעורר תגובה דלקתית של,3,4. עם זאת, טכניקת שטיפה של חלל האף הוא לא ריאלי אצל ילדים צעירים, מציגה גורם לדילול לא ידוע, אשר מבלבל את התוצאות, מתווך מדולל רמות יכול ליפול מתחת לגבול זיהוי של assay5. יתר על כן, בשל הגורם דילול לא ידוע, התגובות analyte נמדד מתוך הבדיקות אתגר האף אינן דומות בין אנשים, וכך להגביל את התועלת של טכניקת שטיפה של חלל האף במדגם הגדרת. לבסוף האתגר אלרגן ישימה רק במקצועות sensitized, אתגרים אחרים, כגון האתגר היסטמין, אינן רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, ובכך לגרום השפעה התקרה על שחרור המתווך. בעיות אלה הם עקפו בטכניקת מבוססי-נייר סינון הציג אוסף נוזלים שורות mucosal, איפה בודדים הפרשת נוזלים ורמות analyte הגורמים היחידים המשפיעים השונות הבין-אישי.
במהלך ההליך החילוץ, analytes הן eluted מהעיתון מסנן לאחר התוספת של אמצעי אחסון זהים המאגר כדי כל הדגימות. זה מעדיף דומה שמחוץ דילול של כל הדגימות. מאגר החילוץ של אלבומין מבוססי תמיסת מלח מול משמש עבור השלב החילוץ; זה מאפשר הפקת מבוססי חלבונים מתווכים ומייצב חלבונים כדי להגביל דנטורציה במהלך ההקפאה עוקבות של חלבונים eluted לפני כמת. כדי למנוע השפלה חלבון במהלך שלב החילוץ, קוקטייל של מעכבי פרוטאז נוסף למאגר החילוץ.
היישום של טכניקות המאפשרות כימות של הפרעה, ויוו-מתווכים חיסוניים שנוצר באתרי הרירית הוא בעל חשיבות עליונה. ראשית, האתר הרירית מפצה אימונולוגי האיבר הגדול ביותר בגוף. שנית, המיקום האף הוא אתר ראשי של חשיפה לאוויר, קשורה באופן הדוק תא אימונולוגי הנשימה של הריאות1. שלישית, האפשרות של מדידות איבר חשוב זה עם שיטה לא פולשנית פותחת את האפשרות לספק שפע של מידע על ציר חשוב חיידק-החיסון אינטראקציה ביחס מחלה את דרכי הנשימה ובריאות. רביעית, יש הרבה יישומים אפשריים אחרים של טכניקה זו, כגון לימוד שינויים המקומיות אימונולוגי בניסויים אקראי, מבוקר של סמים, יסודות קורט.
אנחנו בתחילה ליישם את הטכניקה מחקרים פוטנציאליים קופנהגן על אסטמה במדגם2000 (COPSAC2000) ילדות, שבו קבענו את הפרופיל החיסונית של נוזל שורות mucosal בת 7 ילדים עם דלקת אלרגית לעומת פקדים בריא13. לאחר מכן, אנחנו הוחלו בהצלחה טכניקה זו האורך COPSAC2010 עוקבה ופרופילים דרכי הנשימה המוערך המערכת החיסונית 1 חודש, 2 שנים ולאחר 6 שנים של גיל ועל מופעים של תסמינים נשימתיים חריפה. תוצאות neonates בן חודש 1 הראו אגודות חשוב בין החתימה מערכת החיסון לבין חשיפה סביבתית מוקדמת-חיים7,8,9,10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם הטכניקה המובאת כאן, הצלחנו לקבוע את ויוו דרכי הנשימה העליונה הרירית פרופיל החיסונית אצל ילדים מוקדם ככל חודש של גיל, אשר לא נעשה בעבר. . הבחנו שהנוכחות של חיידקים מסוימים את דרכי הנשימה, picornaviruses7,11, כמו גם אחרים טרום, חשיפות הלידה, היו שיקוף בפרופיל המע…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מביעים את הכרת התודה שלנו ילדים ומשפחות של מחקר עוקבה2010 COPSAC עבור כל התמיכה והמחויבות שלהם. אנו להכיר, להעריך את המאמצים ייחודי של צוות המחקר COPSAC ואת עזרת טכני טכנאי ליסבת Buus Rosholm, האוניברסיטה הטכנית של דנמרק, לשקילת ציטוקינים ו נוגדנים.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
Riferimenti
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
