En protokol til omfattende ekstraktion af lipider, metabolitter og proteiner fra biologiske væv under anvendelse af en prøve er præsenteret.
Forståelse af komplekse biologiske systemer kræver måling, analyse og integration af flere sammensatte klasser af levende celle, som regel bestemmes af transkriptomiske, proteomiske, metabolomiske og lipidomiske målinger. I denne protokol introducerer vi en simpel metode til reproducerbar ekstraktion af metabolitter, lipider og proteiner fra biologiske væv under anvendelse af en enkelt alikvot pr. Prøve. Ekstraktionsmetoden er baseret på et methyl tert -butylether: methanol: vandsystem til væske: flydende opdeling af hydrofobe og polære metabolitter i to ublandbare faser sammen med udfældningen af proteiner og andre makromolekyler som en fast pellet. Denne metode tilvejebringer derfor tre forskellige fraktioner af specifik molekylær sammensætning, som er fuldt kompatible med almindelige højtydende 'omics' teknologier såsom væskekromatografi (LC) eller gaskromatografi (GC) koblet til massespektrometre. Selv om metoden var initIalt udviklet til analyse af forskellige plantevævsprøver har det vist sig at være fuldt kompatibel til udvinding og analyse af biologiske prøver fra systemer, der er så forskellige som alger, insekter og pattedyrvæv og cellekulturer.
Systembiologi, der opstod i midten af det sidste århundrede 1 og blev fremmet ved storskalaanalysen af genomiske og transkriptomiske datasæt 2 , 3 , har udviklet sig til en ny og uundværlig tilgang til analysen af komplekse biologiske systemer 4 , 5 . Hovedformålet med systembiologi er at dechiffrere komponentinteraktionerne og afhængighederne i biologiske systemer og at broere forbindelsen mellem genotyper, deres realisering, molekylære transformationer og resulterende fænotyper. Derfor er integrationen af omfattende datasæt, der er produceret af de forskellige analysemetoder i stor skala, nemlig genomics, transcriptomics, metabolomics, lipidomics og proteomics og deres beregningsanalyse blevet en forudsætning for beskrivelse og forståelse af komplekse biologiske systemer.
Bas Redegør for den enorme kemiske mangfoldighed og kompleksitet af biologiske komponenter i ethvert levende system, afhænger produktionen af store og omfattende 'omics'-datasæt stærkt på kvaliteten af den anvendte ekstraktionsmetode 9 . Ud over kvaliteten af ekstraktionsmetoden er metoden økonomi vigtig; Dette betyder, at det ville være ønskeligt at opnå så meget molekylær information fra så lidt prøveindgang som muligt. Ofte kan prøve mængder være begrænsende, og derfor er det yderst ønskeligt at anvende en ekstraktionsmetode, som kan udlede så mange molekylære klasser fra en enkelt ekstraktion af en given prøve. Dette betyder, at i stedet for at anvende flere specialiserede ekstraktionsmetoder til ekstraktion af forskellige sammensatte klasser fra forskellige prøvealikvoter af den samme prøve anvendes en sekventiel ekstraktionsmetode, som fraktionerer de molekylære bestanddele i en enkelt alikvot i forskellige molekylfraktioner.
Den fælles metode anvendt til disse fraktionerede ekstraktionsmetoder er baseret på tofase-lipidekstraktionsmetoden fra Folch et al., Udviklet i 1957 10. Denne fremgangsmåde er baseret på en chloroform: methanol / vandopdeling af polære og hydrofobe metabolitter og var Beregnet til oprydning og afkompleksprøver til højkvalitets lipidanalyse. Med udviklingen af multi-omics-systembiologi blev Folch-metoden yderligere trinvist forbedret ved at anvende den til prøveopdeling af proteiner og polære metabolitter og lipider til Gas- og væskekromatografi-baserede metabolomikker og lipidomika af polære og hydrofobe forbindelser ud over væskekromatografi-baserede proteomika 11 , 12 , 13 , 14. Desværre er alle disse fremgangsmåder afhængige af en chloroformbaseret ekstraktionsmetode, som ikke alene Fører til den uønskede foRation af proteinpelleten som en interfase mellem den polære og lipidfasen, men som også er et uønsket opløsningsmiddel fra et grønt kemiperspektiv 15 , 16 . Opløsningsmidlet methyl- tert -butylether (MTBE) overvinder imidlertid begge disse ovennævnte problemer og er en egnet erstatning for chloroform. På baggrund af disse krav besluttede vi at etablere en MTBE: methanol: vandbaseret ekstraktionsmetode, som opfylder alle ovennævnte specifikationer og derfor fungerer som et ideelt udgangspunkt for omfattende multi-omics analyse 16 .Denne protokol styrer brugeren trin for trin gennem den enkle, hurtige og reproducerbare arbejdsgang i prøvepræparatet, herunder fejlfinding af almindeligt observerede problemer. Endvidere vil vi kort introducere eksemplariske analytiske data fra ultrapræstationsvæskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS) -basEd lipidomics, metabolomics og proteomics profilering fra plantevævsprøver. Selv om de givne eksempler er afledt af 50 mg af en Arabidopsis thaliana leafvævsprøve , er denne protokol blevet anvendt til adskillige andre biologiske prøver og væv, herunder alger 17 , 18 , insekter 19 og pattedyrsceller, organer og væv 20 , 21 , 22 . Omfanget af den præsenterede ekstraktionsprotokol er at tilvejebringe en klar og detaljeret beskrivelse af forudvindingsprøvehåndteringen og selve udvindingsproceduren. Selvom vi giver tre korte eksempler på analytisk anvendelse, kan vi få detaljerede oplysninger om den forud- og postanalytiske datahåndtering fra vores tidligere publikationer 16 , 23 , 24 , <supClass = "xref"> 25 , 26 .
I denne artikel beskriver og illustrerer vi en enkel og meget anvendelig ekstraktionsprotokol til omfattende lipidomisk, metabolomisk og proteomanalyse fra en enkelt 50 mg bladprøve. Metoden har tidligere været anvendt i flere undersøgelser, som er blevet offentliggjort i forskellige artikler 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 Og viste sig, ud over sin straight-forwardWorkflow og høj anvendelighed er robuste og reproducerbare.
De her tilvejebragte ansøgninger viser nogle rutinemetoder til indledende screening af en kompleks biologisk prøve. Disse illustrerede storskala metabolomiske og lipidomiske datasæt kan give fuldstændig information om de brede eller specifikke ændringer i metabolisme af det analyserede biologiske system, mens dataene opnået ved analyse af proteiner giver indsigt i kvantitative (overflod) og kvalitative (modifikationer ) Ændringer af enzymer, strukturelle proteiner eller transkriptionsfaktorer (TF'er), der styrer cellulære funktioner og maskiner. Følgelig har integrative omics-data potentialet til at afsløre initial information om mulige ændringer induceret af genetiske eller biotiske og / eller abiotiske forstyrrelser af et biologisk system ved at belyse molekylære ændringer af forskellige molekyler associeret med specifikke metaboliske veje eller cellulære processer.
SelvfølgeligPå lang sigt er det helt afgørende for en vellykket systembiologianalyse at maksimere antallet af analyserede og annoterede molekylære enheder, hvilket muliggør overvågning af cellulære funktioner og aktiviteter så fuldstændigt som muligt. Til dette formål kunne de opnåede fraktioner anvendes i tillæg til forskellige analytiske metoder, der målretter mod yderligere forbindelser eller sammensatte klasser ( figur 4 ).
Når det er sagt, må det nævnes, at den globale analysestrategi for de opnåede data kan følges ved to forskellige strategier: På den ene side har vi lagt vægt på belysningen af cellulære funktioner ved kvantificering af kendte forbindelser. På den anden side er mange af de målte metabolitter og lipider endnu ikke kendt eller annoteret. Disse ikke-annoterede sammensatte målinger indeholder også masser af meningsfuld information, som kan anvendes ved statistiske metoder til klassificering eller diskrimination bEtween grupper eller behandlinger 20 , 21 , 22 .
Alligevel skal disse ukendte forbindelser, især dem der er relevante for gruppeklassifikation eller betjening som biomarkører, identificeres. Denne identifikationsproces er desværre ganske kedelig og kan ikke opnås uden yderligere analytiske målinger eller strategier 38 . Som det fremgår af figur 4 er antallet af ikke-annoterede forbindelser ganske højt (faktisk langt størstedelen). Ikke desto mindre, som nævnt ovenfor, kan disse kromatografiske toppe håndteres inden for dataanalysen, og derfor kan signifikant berørte enheder belyses og underkastes yderligere identifikationsstrategier.
Sammenfattende kan vi konkludere, at den her indførte protokol giver flere fordele for eksperimentelle systembiologi såvel som for klassisk statistisk applikationtioner.
For det første reduceres variationen mellem de forskellige eksperimentelle datasæt (lipider, metabolitter, proteiner), da alle fraktioner ekstraheres fra en enkelt prøve, da hvert datasæt er afledt fra den samme prøvealikvot. Dette fører klart til den øgede sammenlignelighed af de opnåede resultater.
For det andet er metoden let skalerbar og gør den derfor meget kompatibel med små til store prøve mængder. Vi bruger rutinemæssigt 10-100 mg vævsprøver, men vellykkede lipidomiske undersøgelser er også blevet udført på så lidt som 20 arabidopsisfrø 31 . Især kompatibiliteten med små prøve mængder gør denne metode gældende, hvis der er begrænsede mængder biologiske væv eller prøver. Selv om der foreligger tilstrækkeligt prøvemateriale, giver den her beskrevne metode den fordel at anvende disse prøver i et større antal eksperimentelle replikater i stedet for digSyng dem for forskellige udvindingsprocedurer. Dette giver mulighed for en bedre og raffineret statistisk data analyse.
For det tredje, da fremgangsmåden er baseret på en væske-væskefraktionering af polære og ikke-polære molekyler, tilvejebringer det i modsætning til simple enfase-ekstraktionsmetoder ( fx metanolekstraktioner) et signifikant de-kompleksdannelsestrin i proceduren. Denne effektive prøve-de-kompleksdannelse fører til en delvis oprensning af de individuelle fraktioner som følge af adskillelsen af kemisk interfererende molekyler fra hinanden. Følgelig giver den kemiske partitioneringsproces ikke kun en praktisk fordel for systematisk alikvotering af de ekstraherede prøver i forskellige kemiske klasser, men forbedrer også de enkelte analytiske målinger, da det fjerner forurenende forbindelser fra de forskellige fraktioner. Det kan klart ses, at især lipiderne, der er opdelt i den organiske fase, og som normalt påvirkerKromatografisk analyse af polære forbindelser vil være næsten fuldstændig fraværende fra den polære fraktion. Det samme gælder for analysen af de hydrofobe lipider, som vil blive udarmet af de polære forbindelser. Udover rensningen af polære og ikke-polære forbindelser fra hinanden nedbryder og samler vi proteiner og andre makromolekyler fra prøven, som ikke kun tilvejebringer en separat fraktion, der kan anvendes til protein-, stivelse- og cellevægsanalyse 16 , men også Fører til en renere prøve inden for de enkelte fraktioner. Dette er især relevant, da det er kendt, at tilstedeværelsen af store makromolekyler fører til skade eller i det mindste kortere levetid for de analytiske søjler.
Sidst men ikke mindst er den beskrevne MTBE-ekstraktionsmetode, der er baseret på det mindre farlige og mere fordelagtige chloroform-erstatningsmiddel 15 , allerede blevet vist ved flere undersøgelser fra vores gruppe for at være meget applIcability for forskellige biologiske prøver fra planter 16 , alger 17 , 18 , flyver 19 men også adskillige pattedyrvæv, organer eller celler 20 , 21 , 22 .
The authors have nothing to disclose.
MS understøttes af et fuldt ph.d.-stipendium fra GERLS-DAAD-programmet. Vi vil gerne takke Dr. Andrew Wiszniewski for korrekturlæsning og kommentere manuskriptet. Vi er meget taknemmelige for alle medlemmerne af Giavalisco-labet på Max-Planck Institut for Molekylærfysiologi, Golm, Tyskland for deres hjælp.
Reagents and standards | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Equipment | |||
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |