JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Bioingegneria

Forudsigelse af gensvulmning gennem spatiotemporal kontrol af siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers

Published: July 21, 2017
doi:
10.3791/55803
, ,
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering,University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Delaware

Summary

Vi præsenterer en ny metode, der bruger fotobesvarende blokcopolymerer til mere effektiv spatiotemporal styring af gentympning uden påviselige off-target-effekter. Endvidere kan ændringer i genekspression forudsiges ved anvendelse af straightforward siRNA frigivelsesassays og simpel kinetisk modellering.

Abstract

Nye materialer og metoder er nødvendige for bedre at kontrollere bindingen vs. frigivelse af nukleinsyrer til en lang række anvendelser, som kræver præcis regulering af genaktivitet. Navnlig ville nye stimuli-responsive materialer med forbedret spatiotemporal kontrol over genekspression åbne for oversættelige platforme i lægemiddelforskning og regenerativ medicinteknologi. Desuden ville en forøget evne til at styre nukleinsyrefrigivelse basis muliggøre udviklingen af strømlinede metoder til at forudsige Nanobærer virkningsfuldhed a priori, hvilket fører til fremskyndet screening af leveringsvehikler. Her præsenterer vi en protokol til forudsigelse af genlyddningseffektivitet og opnåelse af spatiotemporal kontrol over genekspression gennem et modulært fotoresvarende nanocarrier-system. Lille interfererende RNA (siRNA) komplekseres med mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoxy) -2-nitrobenzylmethacrylat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymerer tilRm stabile nanocarriers, der kan styres med lys for at lette afstemning, on / off siRNA release. Vi skitserer to komplementære analyser, der anvender fluorescenskorrelationsspektroskopi og gelelektroforese til den nøjagtige kvantificering af siRNA-frigivelse fra opløsninger, der efterligner intracellulære miljøer. Oplysninger opnået fra disse assays blev inkorporeret i en simpel RNA interferens (RNAi) kinetisk model for at forudsige de dynamiske afstødningsresponser på forskellige foto-stimulusbetingelser. Til gengæld tillod disse optimerede bestrålingsbetingelser forfining af en ny protokol til spatiotemporalt styring af gentympning. Denne metode kan generere cellulære mønstre i genekspression med celle til celleopløsning og ingen påviselige off-target-effekter. Tværtimod tilbyder vores tilgang en nem at bruge metode til at forudsige dynamiske ændringer i genekspression og præcis styring af siRNA-aktivitet i rum og tid. Dette sæt assays kan let tilpasses til at teste en bred vifte af otHendes stimuli-responsive systemer for at imødegå vigtige udfordringer, der er relevante for en lang række anvendelser inden for biomedicinsk forskning og medicin.

Introduction

Små interfererende RNA'er (siRNA'er) medierer post-transkriptionelt gensilring gennem en katalytisk RNAi-vej, der er yderst specifik, kraftig og skræddersyet til stort set ethvert målgen 1 . Disse lovende egenskaber har gjort det muligt for siRNA-terapeutika at udvikle sig i humane kliniske forsøg til behandling af talrige sygdomme, herunder metastatisk melanom og hæmofili 2 , 3 . Imidlertid fortsætter betydelige leveringsproblemer, som har forhindret oversættelse 4 . Leveringskøretøjer skal især forblive stabile og beskytte siRNA'er mod ekstracellulær nedbrydning, men frigive også nyttelasten i cytoplasma 5 . Desuden kræver mange RNAi-applikationer forbedrede fremgangsmåder til regulering af gentympning i rum og tid 6 , hvilket vil reducere bivirkninger i siRNA-terapeutik 7 og muliggøre transformativ aDvances i applikationer, der spænder fra celle-mikroarrays til lægemiddelforskning 8 til modulering af celleresponser i regenerative stilladser 9 . Disse udfordringer fremhæver behovet for nye materialer og metoder til bedre at kontrollere binding mod frigivelse i siRNA nanocarrier.

En af de mest lovende strategier til styring af siRNA frigivelse og forbedring af spatiotemporal regulering er brugen af ​​stimuli-responsive materialer 10 . For eksempel er en bred vifte af biomaterialer blevet konstrueret med foranderlig nukleinsyrebindingsaffinitet som reaktion på ændret redoxpotentiale eller pH eller anvendte magnetfelter, ultralyd eller lys 11 . Selv om mange af disse systemer viser forbedret kontrol over nukleinsyreaktivitet, er anvendelsen af ​​lys som en trigger særligt fordelagtig på grund af dens øjeblikkelige tidsmæssige respons, præcis rumlig opløsning og nem afstemning <suP class = "xref"> 12. Desuden er potentialet ved fotoknitiske teknologier til regulering af genekspression blevet påvist ved hjælp af state-of-the-art inducerbare promotor og optogenetiske regulatorsystemer; Imidlertid lider disse systemer af mange udfordringer, herunder begrænset kapacitet til at regulere endogene gener, sikkerhedsproblemer som immunogenicitet og vanskeligheder med at levere multikomponent-samlinger 13 , 14 , 15 . Foto-responsive siRNA nanocarrier er ideelt egnet til at overvinde disse ulemper og tilvejebringe en enklere og mere robust tilgang til spatiotemporalt modulere genekspression 16 , 17 , 18 . Desværre forbliver metoder til nøjagtigt at forudsige det resulterende proteinknockdown-svar uvæsentligt.

En vigtig udfordring er, at kvantitative evalueringer af siRNA-udgivelsen erSjældne 19 , 20 , og selv når disse evalueringer udføres, er de ikke blevet koblet til analyser af siRNA / proteinomsætningsdynamik. Både mængden af ​​frigivet siRNA og dens persistens / levetid er vigtige determinanter for den resulterende gendæmpningsdynamik; En mangel på sådanne oplysninger er derfor en stor afbrydelse, der udelukker nøjagtig forudsigelse af dosisrespons i RNAi 21 . Adressering af denne udfordring ville fremskynde formuleringen af ​​de relevante struktur-funktion forhold i nanocarrier og bedre informere biomaterialedesigner 22 . Desuden ville sådanne fremgangsmåder muliggøre udvikling af mere effektive siRNA doseringsprotokoller. I et forsøg på at forstå det dynamiske lydsvarssvar har flere grupper undersøgt matematiske modeller af RNAi 23 , 24 , 25 . Disse rammer varSucces med at give indsigt i siRNA-medierede ændringer i genekspression og identificere hastighedsbegrænsende trin 26 . Imidlertid er disse modeller kun blevet anvendt til kommercielle genleveringssystemer ( fx lipofektamin og polyethylenimin (PEI)), der ikke er i stand til kontrolleret siRNA-frigivelse, og kompleksiteten af ​​modellerne har alvorligt begrænset deres anvendelighed 27 . Disse mangler fremhæver et ubehøvet behov for nye materialer, der er i stand til præcist indstillelig siRNA-frigivelse kombineret med strømlinede og nemme at bruge prædiktive kinetiske modeller.

Vores metode behandler alle disse udfordringer gennem integration af en lysfølsom nanocarrier platform med koblede metoder til at kvantificere fri siRNA og model RNAi dynamik. Specielt overvåges vores platforms præcist styrede siRNA-udgivelse 28 ved hjælp af to komplementære metoder til nøjagtigt kvantificering af indkapslede kontra uBundet siRNA. De eksperimentelle data fra disse analyser indføres i en simpel kinetisk model for at forudsige genlydningseffektiviteter a priori 29 . Endelig udnyttes nanokarrierernes on / off-natur let for at frembringe cellemønstre i genekspression med rumlig kontrol på cellelængde skalaen. Således tilvejebringer denne metode en let tilpasningsbar metode til styring og forudsigelse af gentympning i en række forskellige applikationer, der ville have gavn af spatiotemporal regulering af celleadfærd.

Protocol

1. Formulering af siRNA nanocarrierer Forbered separate opløsninger af siRNA og mPEG- b -P (APNBMA) med lige mængder fortyndet i 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre (HEPES) buffer ved pH 6,0. Tilsæt siRNA i en koncentration på 32 μg / ml til 20 mM HEPES-opløsning. BEMÆRK: siRNA var en ikke-målrettet, universel negativ kontrol sekvens; SiRNA'en kan imidlertid være designet til at målrette mod ethvert gen af ​​interesse. Opl…

Representative Results

Efter formuleringen af ​​nanocarriererne blev der udført siRNA-frigivelsesassays for at informere bestrålingsbetingelserne, som skal anvendes i in vitro- transfektionerne. Forskellige doser af lys blev påført for at bestemme procenten af ​​siRNA, der blev frigivet. Det første assay anvendte gelelektroforese til adskillelse af de frie siRNA-molekyler fra siRNA-molekylerne, der stadig er kompleksbundet / associeret med polymeren. Nanocarrier, der ikke blev behandlet m…

Discussion

Der er et par trin i den metode, der er særlig kritisk. Ved formulering af nanocarriererne er rækkefølgen af ​​komponenttilsætning og blandingshastighed to vigtige parametre, der påvirker effekten 39 . Denne protokol kræver, at den kationiske komponent, mPEG- b -P (APNBMA), tilsættes til den anioniske komponent, siRNA, dråbevis under vortexing. Afhængig af det totale formuleringsvolumen tager denne blandeproces 3-6 s. For at teste om nanocarriererne blev dannet ordentligt, m…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health (NIH) for økonomisk støtte gennem en institutionel udviklingspris (IDeA) under tildelingsnummer P20GM103541 samt tildelingsnummer P20GM10344615. Udtalelserne heri afspejler ikke NIH's synspunkter. Vi anerkender også Delaware Biotechnology Institute (DBI) og Delaware Economic Development Office (DEDO) for økonomisk støtte gennem Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) -prisen (12A00448).

Materials

siRNA Sigma-Aldrich SIC001 non-targeted, universal negative control
mPEG-b-P(APNBMA) synthesized in our lab N/A photo-responsive polymer
HEPES Fisher Scientific BP310-100
sodium dodecyl sulfate  Sigma-Aldrich 436143
rubber gasket McMaster-Carr 3788T21 0.5 mL thick
UV laser  Excelitas Technologies Omnicure S2000 collimating lens and 365 nm filter used
agarose Fisher Scientific BP160-100
ethidium bromide Fisher Scientific BP1302-10
siRNA labelled with Dy547 GE Healthcare Dharmacon, Inc. custom order fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand
microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 pre-cleaned glass
Secure-Seal Spacer Life Technologies S24735 double-sided adhesive
LSM 780  Carl Zeiss N/A confocal microscope
ZEN 2010 Carl Zeiss N/A FCS analysis software
MATLAB MathWorks N/A programming language
NIH/3T3 cells  ATCC ATCC CRL-1658
DMEM Mediatech 10-013-CV growth media
fetal bovine serum Mediatech 35-011-CV heat-inactivated
penicillin-streptomycin Mediatech  30-002-CI
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
Opti-MEM Life Technologies 11058021 transfection media
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
  2. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
  3. Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
  4. Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
  5. Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
  6. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  7. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  8. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
  9. Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
  10. Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
  11. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
  12. Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
  13. Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
  14. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
  17. Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
  18. Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
  21. Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
  22. Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
  23. Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
  24. Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
  25. Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
  26. Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
  27. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
  28. Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
  29. Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
  30. Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
  31. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
  35. Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
  36. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
  39. Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
  40. Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
  41. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  42. Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).

Tags

Gene SilencingSiRNA ReleasePhoto-responsive Polymeric NanocarriersSpatiotemporal ControlStructure-function RelationshipsStimuli-responsive DeliveryKinetic ModelingGene Expression ControlPhoto-responsive PolymersN/P RatioSDS SolutionUV LaserNanocarrier Solution
check_url/it/55803?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Greco, C. T., Epps, III, T. H., Sullivan, M. O. Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers. J. Vis. Exp. (125), e55803, doi:10.3791/55803 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image