Preparazione su media scala di<em&gt; Drosophila</em&gt; Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un approccio semplice e poco costoso per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g) e la preparazione di estratti proteici che possono essere utilizzati nelle applicazioni proteomiche a valle, come la spettrometria di massa di purificazione-affinità (AP-MS ).

Abstract

L'analisi delle interazioni proteine-proteine ​​(PPI) è diventata un approccio indispensabile per studiare processi e meccanismi biologici, come la segnalazione cellulare, lo sviluppo dell'organismo e la malattia. Spesso è auspicabile ottenere informazioni PPI utilizzando materiale in vivo , per ottenere la visione più naturale e imparziale delle reti di interazione. La mosca di frutta Drosophila melanogaster è un'ottima piattaforma per studiare i PPI in vivo e si presta ad approcci semplici per isolare il materiale per esperimenti biochimici. In particolare, gli embrioni a base di frutta rappresentano un tipo di tessuto conveniente per studiare PPI, a causa della facilità di raccolta degli animali in questa fase di sviluppo e del fatto che la maggior parte delle proteine ​​sono espresse in embriogenesi, fornendo così un ambiente rilevante per rivelare la maggior parte dei PPI. Qui presentiamo un protocollo per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g), che è una quantità ideale per una vasta gamma diApplicazioni proteomiche, compresa l'analisi di PPI per purificazione di affinità-spettrometria di massa (AP-MS). Descriviamo i nostri disegni per le gabbie da 1 L e 5 L per le collezioni di embrioni che possono essere facilmente e poco costose in qualsiasi laboratorio. Inoltre forniamo un protocollo generale per la raccolta di embrioni e per l'estrazione di proteine ​​per generare lisati che possono essere utilizzati direttamente nelle applicazioni a valle, ad esempio AP-MS. Il nostro obiettivo è quello di fornire un mezzo accessibile a tutti i ricercatori per effettuare le analisi di PPI in vivo .

Introduzione

Gli schermi genetici e, più di recente, gli approcci genomici hanno rivoluzionato lo studio delle funzioni biologiche. Tuttavia, importanti informazioni cellulari sono codificate in proteine ​​e nel loro insieme di partner interagenti. Mentre le schermate di modifica genetica tradizionali possono identificare componenti di percorso che limitano il tasso e recuperare interazioni indirette, la forza degli approcci proteomici è nella loro capacità di identificare reti complete di interazione immediata di proteine ​​di interesse. La proteomica è quindi un prezioso metodo ortogonale per studiare sistemi biologici e completa la genomica, le trascrizioni e gli schermi genet....

Protocollo

1. Preparazione di 5 gabbie di mosche (per inserire piatti da 15 cm)

1. Ottenere i materiali necessari: contenitore da 5 quart (4.7 litri) con coperchio ( figura 1A ), maglia in nylon e una lama di rasoio.
2. Segnare un cerchio di 12 cm di diametro e tagliare un foro nella parte inferiore del contenitore utilizzando la lama del rasoio ( figura 1B ). Tagliare un foro di diametro di 15 cm nel coperchio ( figura 1C ).
3. Taglia la maglia di nylon in piazze da 25 x 25 cm.
4. Mettere la maglia sul bordo superiore del contenitore e premere con il coperchio....

Risultati

Per illustrare l'uso di questo protocollo in un esperimento di purificazione complessa di proteine, abbiamo generato una linea fly flygable omozigote, arm-EGFP-ERK , che esprimeva EGFP-tagged Drosophila chirurgia extracellulare-regolata (ERK, codificata dal gene laminato ) sotto il controllo Di un promotore armadillo ( braccio ) espresso in modo omnicomprensivo ^{18 , 19} . Il pro.......

Discussione

Il protocollo qui presentato è una procedura semplice e generale per la creazione di gabbie di popolazione Drosophila a media scala e la realizzazione di proteine ​​intere di cellule da embrioni. Gli estratti risultanti possono essere utilizzati in una varietà di applicazioni a valle, come la purificazione di complessi proteici sulle resine di affinità. È fondamentale eseguire le fasi di estrazione sul ghiaccio e utilizzare una forte inibizione della proteasi, per minimizzare il degrado delle proteine. Come des.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Leaktite 5-Qt. Contenitore Multi Mix Naturale (Confezione da 3)	Home Depot	209330	Per realizzare gabbie da 5 L.
Leaktite 5-Qt. Coperchio Multi Mix Naturale (Confezione da 3)	Home Depot	209320	Diametro 8,37 in. Coperchi per gabbie da 5 litri.
Piastre Petri Fisherbrand con coperchio trasparente, 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	Materiale: Polistirolo. Da utilizzare con gabbie da 1 L.
Piastre Petri Fisherbrand con coperchio trasparente, 150 x 15 mm	Fisher Scientific FB0875714		Materiale: Polistirolo. Da utilizzare con gabbie da 5 litri.
Fisherbrand Piastre Petri con coperchio trasparente, 60 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	Materiale: Polistirolo. Utilizzato durante la decorionazione dell'embrione.
Sefar NITEX rete in nylon	Sefar	03-180/44	180 micron, 44% area aperta, utilizzata per gabbie antimosche.
Milwaukee 3 pollici. Sega a tazza apripista con Arbor	Home Depot	49-56-9670	Utensile da taglio da 3 pollici per la realizzazione di gabbie da 1 L.
Barattoli in PMP a bocca larga Nalgene con chiusura a vite in polipropilene bianco	Fisher Scientific	11-823-33	Per la realizzazione di gabbie da 1 L. Thermo Scientific gatto # 21171000. È possibile utilizzare contenitori alternativi da 1 L.
Lievito secco attivo Red Star, busta da 2 libbre	Red Star		Può essere acquistato da Amazon.com o da altri fornitori.
Concentrato di succo di mela congelato al 100%			Può essere acquistato in un negozio di alimentari. Deve dire "100% succo di mela" sulla lattina.
Il metil4-idrossibenzoato	Acros Organics	AC126965000	noto anche come metilparabene o Tegosept. Usato come conservante nelle piastre AJ.
IGEPAL CA-630 per biologia molecolare, 100 ml	Sigma	I8896	utilizzato per la preparazione del tampone di lisi.
Unità filtranti monouso sterili a flusso rapido Nalgene con membrana CN	Fisher Scientific	09-740-2A	0,2 μ m dimensione dei pori. Utilizzato per filtrare il tampone di lisi 5x. Thermo Scientific gatto # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor	Sigma	11697498001	Flaconcino da 20 compresse. Utilizzato per l'inibizione della proteasi nel tampone di lisi.
Filtri per siringhe Corning SFCA	Fisher Scientific	09-754-21	Membrana SFCA, diametro 26 mm, dimensione dei pori 0,45 &m. Utilizzata per filtrare i campioni di estratto finale.
BD  Siringhe monouso Luer-Lok senza aghi	Fisher Scientific	14-823-2A	per filtrare i campioni di estratto finale. BD gatto # 309604.
La candeggina	Clorox		utilizzata per la decorionazione degli embrioni al 50% (vol/vol) in acqua, può essere acquistata in qualsiasi supermercato. È importante utilizzare il marchio Clorox, poiché altre marche possono causare una decorionazione incompleta o possono essere tossiche per gli embrioni.
Corning Costar Netwell Plates	Fisher Scientific	07-200-213	contenitori a rete per collezioni di embrioni. 74 μ m dimensione della maglia, 6 pozzetti.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacità 15 ml	Fisher Scientific	06-435B	omogeneizzatore per embrioni, con pestelli sciolti e stretti. Gatto Wheaton # 357544.