该协议描述了称为求爱条件的果蝇学习和记忆测定。这种经典的测定是基于不接受预先的女性的性拒绝后男性求爱行为的减少。这种自然形式的行为可塑性可用于测试学习,短期记忆和长期记忆。
通过在模型生物体(如果蝇, 黑腹果蝇)中使用简单的行为分析,已经阐明了对学习和记忆底层的分子机制的许多见解。 果蝇可用于了解由与智力障碍(ID)和自闭症相关的人类认知障碍相关基因突变引起的认知缺陷的基本神经生物学。这项工作描述了一种使用被称为求爱条件的果蝇的经典范例来测试学习和记忆的方法。男性苍蝇法庭女性使用明显的易于识别的行为模式。预定的女性不接受交配,并将拒绝男性的交配尝试。为了回应这一拒绝,男性苍蝇减少了他们的求偶行为。随着时间的推移,这种学习减少求偶行为是衡量学习和记忆能力的指标。基本的num该测定的理论输出是求偶指数(CI),其定义为男性在10分钟间隔期间花费的时间的百分比。学习指数(LI)是与没有以前的社交相遇的天真苍蝇相比,已经暴露于预先的女性的苍蝇中的CI的相对减少。为了对基因型之间的LIs进行统计学比较,使用了自举的随机化测试。为了说明测定法如何用于解决与学习和记忆有关的基因的作用,本文对此表征了二羟丙酮磷酸酰基转移酶 ( Dhap-at )的泛神经元敲低。 Dhap-at , 甘油磷酸O-酰基转移酶 ( GNPT )的人类直系同源物参与了2型严重软骨发育不全症,特征为严重的ID的常染色体沉默综合征。使用求偶条件测定法,确定Dhap-at是长期记忆所必需的,但不是短期记忆。该结果作为进一步研究潜在分子机制的基础。
在许多物种中,学习和记忆的分子机制是保守的。嗅觉学习和记忆缺陷的果蝇黑腹果蝇突变体系的开创性工作筛选为基础学习和记忆的过程提供了关键的分子洞察1 。这些研究确定了一些参与学习和记忆的第一个基因,如芸香花2 , 失忆 3和猝死4 ,揭示环磷酸腺苷(cAMP)信号传导的关键作用5 。
记忆突变体的早期遗传筛选主要使用嗅觉调理进行。然而,随着时间的推移,出现了几种测量其他形式的学习和记忆的方法。最广泛使用的学习和记忆范式之一以及这里描述的测定法被称为c这是由Siegel和6号馆首先描述的,然后由其他几个研究组7,8,9提炼。求偶调理取决于在交配过程中由男性沉积的雌性腹部上存在特定的信息素(醋酸顺式乙酰胆碱)。感觉女性腹部的cVA自然降低了求偶行为,当加上女性拒绝的行为时,cVA对男性求爱减少的影响显着增强。通过观察其独特的求偶行为,可以容易地量化男性苍蝇的反应,其特征在于朝向和跟随雌性,叩击,延伸和振动翼,舔和尝试交配10 ( 图1A )。雄蝇学会区分接受处女和不接受交配的女性11之间的h,并且在性拒绝之后,他们向不接受的女性展示了9天的求偶行为。这种自然行为可用于阐明学习,短期记忆(STM)和长期记忆(LTM)8,9,12的机制。学习被定义为在训练期间立即减少求偶行为,通常被称为即时回忆记忆,在暴露于配偶女性6,8之后0至30分钟测量。在训练后30分钟和1小时之间测量STM,而训练后24小时最常测量LTM( 图1B )。 STM可以使用1小时训练期诱导,但只持续2-3小时s =“xref”> 6,8。在大多数学习范例中,LTM只能通过间歇反复训练来诱导。 Mcbride 等 (1999) 8显示,三次间隔1小时的培训课程足以诱导持续长达9天的求偶记忆,与单次1小时训练课程诱导的2-3小时相反。 McBride 等人 8还表明,单一的5小时训练课程产生了长达9天的相似的LTM反应。苍蝇不要在这个5小时期间不断地进行法庭训练,实际上是在一次训练中产生自己的间歇训练来诱导LTM。从实践的角度来看,这是非常重要的,大大增加了该测定法可用于研究LTM的容易程度。目前的协议主要针对LTM 11,12采用7小时的单次训练。几项研究调查不同在求偶学习的不同方面具有特定缺陷的突变条件。例如,蘑菇体消融影响STM和LTM,但不学习8 。 遗忘基因的突变首先被定义为使用嗅觉调理3的记忆的特异性调节因子,影响STM而不是学习6 。翻译调节子orb2(oo18 RNA结合(orb)CPEB2亚科)和蜕皮激素信号的破坏专门影响LTM 9,13。因此,求爱条件是解剖学习和记忆不同阶段的机制的有用范例。
这项工作展示了一个优化的实验设置,允许求和条件的相对高通量的测试。此外,它描述了统计分析脚本,并讨论了测定的关键因素。是sh自己在这里认为果蝇基因磷酸二羟基丙酮酰基转移酶 ( Dhap-at ) 在LTM的神经元中是必需的,但不适用于STM。该基因的人类直系同源物, 甘油磷酸O-酰基转移酶 ( GNPAT ),在2型14型的根茎性软骨发育不全症突变中,其特征在于严重的智力障碍,癫痫发作和其他几种临床特征15的常染色体沉默症。在这种情况下,求偶调节可用于功能验证人类疾病基因在学习和记忆中的作用,为机械研究提供依据。
求偶条件测定法是分析果蝇学习和记忆的典型范例。这里提出的协议遵循前面6,7,8,9所述的一般方法,但包括独特方面,如实用指南,专门设备和用于随机化测试的数据分析脚本9,12。使用该协议,可以使用96孔平底块( 图2A )并行分析大量苍蝇,以收集和训练雄性。这些块用PCR粘合剂膜密封,这使得苍蝇在需要时容易接近。此外,这里描述的独特的求爱室允许在近二维空间中同时配对18个男 – 女对,最适合视频分析。定制的求爱室易于使用,并提供建筑计划( 文件S1 , 图2D )。该协议从用于收集测试对象到收集视频数据的文化的建立需要大约20天( 表1 )。视频数据分析需要额外的时间。根据我们的经验,STM测定非常强大。 LTM测定也相当健壮,但对混合环境变量更敏感,因此可能难以掌握。
动物行为可以变化很大。因此,必须小心执行协议中的关键步骤以减少此方差。首先,温和地使用吸气器( 图2B )可以减轻粗暴处理或吹出太强烈的压力。提出个人转让方式从吸气器出发是通过使用负面的地理位置。随着苍蝇往往走起来,可以简单地将吸嘴的尖端向上;在飞行到达提示之前,轻轻的打击就足以让飞出。此外,为了让男性在测试之前进入求爱室,打击往往是没有必要的。
另一个重要的步骤是收集和产生男性考试科目。所有的男性在年轻的时候都必须收集,社会上是天真的。这可以通过在羽化的高峰期期间频繁收集来实现(步骤5.2)。如果在这个紧张的时间内没有收集到男性,他们可能会有早期的社交互动,这可能导致学习不良或CI的高度变异性。应评估的男性测试对象的另一个因素是遗传背景。不同的遗传背景将表现出不同程度的初始求爱,并且一般活动或运动能力也可能不同。当compa环多重基因型,应考虑遗传背景,以避免可能影响李分数的这些混杂因素。此外,应仔细评估CI数据的分布。 CI数据可以是参数和非参数,这取决于基因型或其他环境因素。在某些情况下,如果CI的分布显着地偏离正态分布,那么使用中位数CI而不是用于计算LI的平均值可能会更好。然而,在我们的经验中,中位数或平均CI的使用在数据的统计解释方面没有任何差异,平均CI的使用是文献中的常见做法。
对于成功的求爱条件,在训练期间积极拒绝预先女性的男性求爱意图至关重要。重要的是确保在该测定中使用的预先使用的雌性已经被有效地交配并且是因此不允许交配。这种预先建立在步骤4中制备的交配小瓶中,其中雄性和雌性苍蝇一起饲养4天( 表1 )。随后,可以通过定期检查测试视频和在训练期间观察男性 – 女性对来监测交配。如果交配确实发生,在预备的女性的准备过程中可以采取几种措施。首先,在最佳育种条件下,应先预选女性。可以用酵母糊和折叠滤纸补充小瓶以增加潜在的配对面。在这里描述的条件下,苍蝇的孵化已经在过去产生了强大的预先的雌性,但是这可能在不同的实验室和使用不同的遗传菌株中变化。因此,可能需要通过改变孵育时间和条件来优化预先女性的产生。
求爱行为的定量是该协议的另一个关键步骤。这可以手动或使用专门的软件程序自动完成。自动量化速度快,原则上是无偏见的。已经出版了几个节目21,22,23 ;然而,它们不是直接使用,通常需要专门的视频格式和高级计算技能。手动量化容易准确,但是劳动密集度高,受个体差异和偏差的影响。重要的是要强调,该协议不能满足视频格式化对于CI的自动化量化可能需要的要求。对于手动量化,使用任何简单的视频录制设备,可能产生足够质量的视频,以准确地观察求爱行为。对于自动量化,可能会有所不同要求取决于所使用的软件,如果需要自动量化,用户应彻底调查。
结合可用于苍蝇遗传操作的广泛工具,求偶条件测定提供了强大的读数,可用于解剖学习和记忆中涉及的分子机制和神经元网络。
The authors have nothing to disclose.
我们承认维也纳果蝇资源中心提供果蝇菌株。此外,在本研究中使用从布卢明顿果蝇库存中心获得的种群(NIH P40OD018537)。这项研究部分得到欧盟FP7大型综合网络Gencodys向KK,HvB和AS以及NSERC发现和CIHR项目拨款的支持
P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
Razor blade | – | – | Any sharp will do |
Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
power food | |||
Agar | Sigma | A7002 | |
Yeast | Bruggeman | – | |
Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
Peptone | Sigma | P6838 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4 | Sigma | M2643 | |
CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – | ||
Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
normal food | |||
Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
Yeast | bruggeman | – | |
Corn flour | de Molen | – | |
Sugar | de Molen | – | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – |