Qui presentiamo un protocollo per isolare endosymbionts dalla whitefly Bemisia tabaci attraverso la dissezione e la filtrazione. Dopo l'amplificazione, i campioni di DNA sono idonei per sequenziare e studiare successivamente il mutualismo tra endosymbionts e whitefly.
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Articolo metodologico
Metodi per l'estrazione di Endosymbionts dalla Whitefly
In questo articolo
Sommario
Abstract
I simbionti batterici formano una relazione intima con i loro ospiti e conferiscono vantaggi agli ospiti nella maggior parte dei casi. Le informazioni genomiche sono fondamentali per studiare le funzioni e l'evoluzione dei simbionti batterici nel loro ospite. Poiché la maggior parte dei simbionti non possono essere coltivati in vitro , sono molto importanti metodi per isolare un'adeguata quantità di batteri per il sequenziamento dei genomi. Nella bianca Bemisia tabaci , sono stati identificati diversi endosymbionts e sono previsti di grande importanza nello sviluppo e nella riproduzione dei parassiti attraverso approcci multipli. Tuttavia, il meccanismo che sostiene le associazioni rimane in gran parte sconosciuto. L'ostacolo deriva parzialmente dal fatto che gli endosymbionts in whitefly, perlopiù restrittivi nei batteriociti, sono difficili da separare dalle cellule ospite. Qui riportiamo un protocollo passo per passo per l'identificazione, l'estrazione e la purificazione di endosymbionts dalla bianca B. tabaci principalmente da dissectiOn e filtrazione. I campioni di endosimbione preparati con questo metodo, pur essendo ancora una miscela di diverse specie endosimbiotici, sono adatti per la sequenza successiva del genoma e l'analisi dei possibili ruoli degli endosimbiotici in B. tabaci . Questo metodo può anche essere usato per isolare endosymbionts da altri insetti.
Introduzione
I batteri che formano una relazione intima e simbiotica con i relativi padroni sono diffusi negli artropodi1. Gli endosymbionts sono stati dimostrati di influenzare gli aspetti degli ospiti, come il metabolismo nutrizionale, la riproduzione, le risposte alle sollecitazioni ambientali 2 , 3 , 4 ecc . In quasi ogni fase di sviluppo 5 . Tuttavia, il meccanismo che sostiene le associazioni resta ancora in gran parte sconosciuto. La genomica è di priorità ed importanza quando studia le potenziali funzioni ei ruoli dei batteri. Alcune informazioni ....
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Protocollo
1. Identificazione delle specie di recupero di Whitefly e delle specie crittiche
- Mantenere le specie bianche in cotone Gossypium hirsutum (Malvaceae) (c.Zhe-Mian 1973) in gabbie in condizioni standard di 27 ± 1 ° C, umidità di 70 ± 10% e luce di 14 h: regime di 10 ore scuro.
- Raccogliere una singola adulte bianca e omogeneizzare in 30 μl di tampone di lisi (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, gelattina 0,2% [wt / vol], 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / mL Proteinasi K).
- Incubare l'omogenato a 65 ° C per 1 ora e poi 100 ° C per 10 min.
NOTA: il tempo di incubazione a 65 ° C può esser....
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Risultati
Le specie del complesso B. tabaci del Medio Oriente Asia Minore 1 (MEAM1) sono state prese qui come esempio per la descrizione. Il cotone per l'allevamento di bianche e diverse fasi di sviluppo delle bianche sono riportate in figura 1, tra cui una pianta di cotone, la bianca adulta e le 1. , 2. e 4. ninfa installa di bianca (la nona di secondo istante sembra simile alla quarta nima ). Era ovvio che la nima del quarto
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Discussione
Poiché gli endosimbionti all'interno delle mosche bianche non possono essere coltivati in vitro, la dissezione e l'assemblaggio dei batteriociti è un modo efficace per ottenere abbastanza materiale genetico di endosimbionti. Prima della dissezione, le specie di mosca bianca e gli endosimbionti coinvolti devono essere esplicitamente confermati. La mosca bianca B. tabaci è un complesso di specie con più di 35 specie morfologicamente indistinguibili e diverse specie criptiche possono contenere diversi endo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario a questo studio è stato fornito dal National Key Research and Development Programme (2016YFC1200601) e dalla National Science Foundation of China (31390421).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Taq DNA polimerasi | Takara | R001A | incluso rTaq, 10&volte; Kit di estrazione del DNA tampone e gel dNTP |
| Qiagen | 28704 | ||
| Sistema di sequenziamento del campione di DNA | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtomo | Leica | EM UC7 | |
| Microscopia elettronica a trasmissione | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereomicroscopio | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μ L microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Portafiltro | Millipore | SX0001300 | |
| Filtro a membrana | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μ m SMWP |
| REPLI-g Kit UltraFast Mini Kit | amlificazione del DNA | Qiagen | 150033 |
| NanoDrop | Thermo Scientific NanoDrop | 2000 | |
| Qubit Fluorimetro | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Sequenziatore del genoma | Illumina | Hiseq 2000 |
Riferimenti
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D.
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Ristampe e permessi
