Microscopie photoacoustique à résolution acoustique et optique à commutation commutable pour<em> In vivo</em> Imagerie vasculaire de sang de petit animal
Summary
Ici, on démontre un système de résolution acoustique (AR) et un système de microscopie photoacoustique à résolution optique (OR) (AR-OR-PAM) capable à la fois d'imagerie haute résolution à faible profondeur et d'imagerie tissulaire profonde à faible résolution sur le même échantillon in vivo .
Abstract
La microscopie photoacoustique (PAM) est une modalité d'imagerie invivo à croissance rapide qui combine à la fois l'optique et l'échographie, offrant une pénétration au-delà du chemin libre moyen optique (~ 1 mm de peau) à haute résolution. En combinant le contraste d'absorption optique avec la résolution spatiale élevée de l'échographie en une seule modalité, cette technique peut pénétrer les tissus profonds. Les systèmes de microscopie photoacoustique peuvent avoir une faible résolution acoustique et une sonde profonde ou une résolution optique élevée et une sonde peu profonde. Il est difficile de réaliser une résolution spatiale élevée et une pénétration de grande profondeur avec un système unique. Ce travail présente un système AR-OR-PAM capable à la fois d'imagerie à haute résolution à des profondeurs peu profondes et l'imagerie en tissu profond à faible résolution du même échantillon in vivo . Une résolution latérale de 4 μm avec une profondeur d'image de 1,4 mm utilisant une focalisation optique et une résolution latérale de 45 μm avec une profondeur d'image de 7,8 mm en utilisant la focalisation acoustique ont été couronnées de succèsA démontré l'utilisation du système combiné. Ici, l'imagerie vasculaire de sang de petit animal in vivo est réalisée pour démontrer sa capacité d'imagerie biologique.
Introduction
Les modalités d'imagerie optique haute résolution, telles que la tomographie par cohérence optique, la microscopie confocale et la microscopie multiphotonique, présentent de nombreux avantages. Cependant, la résolution spatiale diminue de manière significative à mesure que la profondeur d'imagerie augmente. Ceci est dû à la nature diffuse du transport de lumière dans les tissus mous 1 , 2 . L'intégration de l'excitation optique et de la détection par ultrasons fournit une solution pour surmonter le défi de l'imagerie optique haute résolution dans les tissus profonds. La microscopie photoacoustique (PAM) est une telle modalité qui peut fournir une image plus profonde que d'autres modalités d'imagerie optique. Il a été appliqué avec succès à des images structurales, fonctionnelles, moléculaires et cellulaires in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 </sup> , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 en combinant le contraste d'absorption optique fort avec la résolution spatiale élevée des ultrasons.
Dans PAM, une impulsion laser courte irradie le tissu / échantillon. L'absorption de la lumière par les chromophores ( par exemple, la mélanine, l'hémoglobine, l'eau, etc. ) entraîne une augmentation de la température, ce qui entraîne la production d'ondes de pression sous forme d'ondes acoustiques (ondes photoacoustiques). Les ondes photoacoustiques générées peuvent être détectées par un transducteur à ultrasons large bande à l'extérieur de la limite tissulaire. En utilisant une faible focalisation acoustique optique et étanche, l'imagerie des tissus profonds peut être obtenue dans la microscopie photoacoustique à résolution acoustique (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . En AR-PAM, une résolution latérale de 45 μm et une profondeur d'imagerie jusqu'à 3 mm ont été démontrées 15 . Afin de résoudre des capillaires individuels (~ 5 μm) acoustiquement, des transducteurs à ultrasons fonctionnant à des fréquences centrales de 400 MHz sont requis. À de telles fréquences élevées, la profondeur de pénétration est inférieure à 100 μm. Le problème causé par la mise au point acoustique étroite peut être résolu en utilisant une focalisation optique étanche. La microscopie photoacoustique à résolution optique (OR-PAM) est capable de résoudre des capillaires simples, ou même une seule cellule 17 , et une résolution latérale de 0,5 μm a été réalisée 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . L'utilisation d'un nanojet photonique peut aider à obtenir une résolution au-delà de la résolution limitée par diffractionN 25 , 26 . Dans OR-PAM, la profondeur de pénétration est limitée en raison de la focalisation de la lumière, et elle peut image jusqu'à ~ 1,2 mm à l'intérieur du tissu biologique 23 . Par conséquent, AR-PAM peut l'image plus profonde, mais avec une résolution plus basse, et OR-PAM peut image avec une très haute résolution, mais avec une profondeur d'imagerie limitée. La vitesse d'imagerie du système AR et OR-PAM dépend principalement du taux de répétition des impulsions de la source laser 27 .
La combinaison de AR-PAM et de OR-PAM sera d'un grand bénéfice pour les applications nécessitant à la fois une image haute résolution et une image plus profonde. De petits efforts ont été faits pour combiner ces systèmes ensemble. Habituellement, deux scanners d'imagerie différents sont utilisés pour l'imagerie, ce qui nécessite que l'échantillon soit déplacé entre les deux systèmes, ce qui rend difficile l'exécution de l' imagerie in vivo . Cependant, l'imagerie hybride avec AR et OR PAM permet l'imagerie avec des résolutions évolutives aNd profondeur. Dans une approche, un faisceau de fibres optiques est utilisé pour délivrer de la lumière pour les AR et OR PAM. Dans cette approche, deux lasers séparés (un laser à haute énergie à 570 nm pour l'AR et un laser à faible intensité et à répétition élevée à 532 nm pour l'OR) sont utilisés, rendant le système incommode et coûteux 28 . La longueur d'onde laser OR-PAM est fixe, et de nombreuses études, par exemple sur la saturation en oxygène, ne sont pas possibles en utilisant ce système combiné. Des études comparatives entre AR et OR PAM ne sont également pas possibles en raison de la différence de longueur d'onde laser entre l'AR et l'OR. En outre, AR-PAM utilise l'éclairage de champ lumineux; Par conséquent, les signaux photoacoustiques forts de la surface de la peau limitent la qualité de l'image. Pour cette raison, le système ne peut pas être utilisé pour de nombreuses applications de bioimagerie. Dans une autre approche pour exécuter AR et OR PAM, la mise au point optique et ultrason est décalée, ce qui rend la mise au point de la lumière et la focalisation ultrasonore non alignées. Ainsi, la qualité de l'image n'est pas optimale <suP class = "xref"> 29. À l'aide de cette technique, AR-PAM et OR-PAM ne peuvent atteindre que des résolutions de 139 μm et 21 μm, ce qui en fait un système à faible résolution. Une autre approche, qui comprend la modification de la fibre optique et de l'optique collimatante, a été signalée pour basculer entre AR et OR PAM, ce qui rend le processus d'alignement difficile 30 . Dans tous ces cas, AR-PAM n'a pas utilisé d'éclairage de champ sombre. L'utilisation de l'illumination en champ sombre peut réduire la génération de signaux photoacoustiques forts de la surface de la peau. Par conséquent, l'imagerie des tissus profonds peut être réalisée à l'aide d'un éclairage en forme d'anneau, car la sensibilité de détection des signaux photoacoustiques profonds sera plus élevée que celle de l'éclairage de champ lumineux.
Ce travail rapporte un système d'imagerie AR et OR PAM (AR-OR-PAM) commutable capable à la fois d'imagerie haute résolution et d'imagerie en profondeur de faible résolution du même échantillon, en utilisant le même laser et scanner pour les deux systèmesEms. La performance du système AR-OR-PAM a été caractérisée par la détermination de la résolution spatiale et de la profondeur d'imagerie en utilisant des expériences fantômes. L' imagerie vasculaire sanguine in vivo a été effectuée sur une oreille de souris pour démontrer sa capacité d'imagerie biologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
En conclusion, un système commutable AR et OR PAM qui permet d'obtenir à la fois une image haute résolution à des profondeurs d'imagerie inférieures et une imagerie basse résolution à des profondeurs d'imagerie plus élevées a été développé. La résolution latérale et la profondeur d'imagerie du système commutable ont été déterminées. Les avantages de ce système PAM commutable comprennent: (1) l'imagerie haute résolution à l'aide d'une focalisation optique étanche; (2) l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien financier d'une subvention de niveau 2 financée par le ministère de l'Éducation à Singapour (ARC2 / 15: M4020238). Les auteurs souhaiteraient également remercier M. Chow Wai Hoong Bobby pour l'aide de l'atelier de mécanique.
Materials
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
Riferimenti
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