Microscopio fotoacustico acustico e ottico<em> In Vivo</em> Piccolo animale Blood Imaging di Vasculature
Summary
Qui viene dimostrato un sistema di microscopia fotoacustica (AR-OR-PAM) di risoluzione acustica (AR) e di risoluzione ottica (AR) in grado di ottenere immagini ad alta risoluzione a profondità poca e immagini a tessuto profondo a bassa risoluzione sullo stesso campione in vivo .
Abstract
La microscopia Photoacoustic (PAM) è una modalità di imaging invivo in rapida crescita che unisce sia l'ottica che l'ultrasuono, fornendo una penetrazione oltre il percorso libero medio ottico (~ 1 mm nella pelle) ad alta risoluzione. Combinando il contrasto di assorbimento ottico con l'alta risoluzione spaziale dell'ecografia in un'unica modalità, questa tecnica può penetrare nei tessuti profondi. I sistemi di microscopia Photoacoustic possono avere una risoluzione acustica bassa e una sonda profondamente o un'alta risoluzione ottica e una sonda poco profonda. È difficile ottenere un'elevata risoluzione spaziale e una grande penetrazione di profondità con un singolo sistema. Questo lavoro presenta un sistema AR-OR-PAM capace sia di immagini ad alta risoluzione che a profondità basse e di imaging a tessuto profondo a bassa risoluzione dello stesso campione in vivo . Una risoluzione laterale di 4 μm con profondità di imaging da 1,4 mm con messa a fuoco ottica e una risoluzione laterale di 45 μm con profondità di immagine di 7,8 mm con focus acustico sono riuscitiDimostrato utilizzando il sistema combinato. Qui viene eseguita un'immagine vascolare di piccole animali in vivo per dimostrare la sua capacità biologica di imaging.
Introduction
Le modalità di imaging ottico ad alta risoluzione, come tomografia di coerenza ottica, microscopia confocale e microscopia multifotonica, hanno numerosi vantaggi. Tuttavia, la risoluzione spaziale diminuisce in modo significativo aumentando la profondità dell'immagine. Ciò è dovuto alla diffusa natura del trasporto leggero nei tessuti molli 1 , 2 . L'integrazione dell'eccitazione ottica e del rilevamento ad ultrasuoni fornisce una soluzione per superare la sfida dell'immagine ottica ad alta risoluzione nei tessuti profondi. La microscopia fotoacustica (PAM) è una tale modalità che può fornire un'immagine più profonda rispetto ad altre modalità di imaging ottico. È stato applicato con successo alla struttura, funzionale, molecolare e immagini in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 </sup> , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , combinando il forte contrasto di assorbimento ottico con l'alta risoluzione spaziale da ultrasuoni.
In PAM, un breve impulso laser irradia il tessuto / campione. L'assorbimento della luce dai cromofori ( es. Melanina, emoglobina, acqua, ecc. ) Provoca un aumento della temperatura, che a sua volta produce la produzione di onde di pressione sotto forma di onde acustiche (onde fotoacustiche). Le onde fotoacustiche generate possono essere rilevate da un trasduttore ultrasonico a banda larga al di fuori del confine del tessuto. Utilizzando la debole ottica e la messa a fuoco acustica stretta, l'imaging in tessuto profondo può essere raggiunto in microscopia fotoacustica (AR-PAM) 14 , 15 e 16 di risoluzione acustica. In AR-PAM, è stata dimostrata una risoluzione laterale di 45 μm e una profondità di imaging fino a 3 mm 15 . Al fine di risolvere acusticamente singoli capillari (~ 5 μm), sono necessari trasduttori ad ultrasuoni a frequenza centrale> 400 MHz. A tali frequenze elevate, la profondità di penetrazione è inferiore a 100 μm. Il problema causato dalla messa a fuoco acustica stretta può essere risolto usando la messa a fuoco ottica stretta. La microscopia fotoacustica (OR-PAM) di risoluzione ottica è in grado di risolvere singoli capillari o persino una singola cellula 17 e una risoluzione laterale di 0,5 μm è stata raggiunta 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . L'uso di un nanojet fotonico può aiutare a raggiungere una risoluzione al di là della risoluzione di diffrazione limitataN 25 , 26 . In OR-PAM, la profondità di penetrazione è limitata a causa della messa a fuoco leggera e può raggiungere fino a 1,2 mm all'interno del tessuto biologico 23 . Pertanto AR-PAM può acquisire un'immagine più profonda, ma con una risoluzione inferiore e l'immagine OR-PAM può avere un'immagine molto elevata, ma con una profondità di imaging limitata. La velocità di imaging del sistema AR e OR-PAM dipende principalmente dalla frequenza di ripetizione impulso della sorgente laser 27 .
La combinazione di AR-PAM e OR-PAM sarà di grande utilità per applicazioni che richiedono sia un'immagine ad alta risoluzione che un'immagine più profonda. Sono stati fatti pochi sforzi per combinare questi sistemi insieme. Di solito, vengono utilizzati due scanner di imaging diversi per l'imaging, che richiede che il campione venga spostato tra i due sistemi, rendendo così difficile l'esecuzione di immagini in vivo . Tuttavia, l'imaging ibrido con AR e OR PAM consente di acquisire immagini con risoluzioni scalabili aProfondità. In un approccio, un fascio di fibre ottiche viene utilizzato per fornire la luce sia per l'AR che per l'OR PAM. In questo approccio vengono utilizzati due laser separati (un laser ad alta energia a 570 nm per l'AR e un laser ad alta velocità di ripetizione a 532 nm per l'OR), rendendo il sistema scomodo e costoso 28 . La lunghezza d'onda del laser OR-PAM è fisso e molti studi, come la saturazione dell'ossigeno, non sono possibili utilizzando questo sistema combinato. Studi comparativi tra AR e OR PAM non sono inoltre possibili a causa della differenza tra le lunghezze d'onda laser tra AR e OR. Inoltre, AR-PAM utilizza l'illuminazione a campo luminoso; Quindi, i segnali fotoacustici forti dalla superficie della pelle limitano la qualità dell'immagine. Per questo motivo, il sistema non può essere utilizzato per molte applicazioni di bioimaging. In un altro approccio per eseguire AR e OR PAM, viene spostato l'obiettivo ottico e ultrasonico, che rende non focalizzati la messa a fuoco della luce e l'ultrasuono. Pertanto, la qualità dell'immagine non è ottimale <suP class = "xref"> 29. Utilizzando questa tecnica, AR-PAM e OR-PAM possono raggiungere rispettivamente solo 139 μm e 21 μm risoluzioni, rendendolo un sistema di scarsa risoluzione. Un altro approccio, che include la modifica della fibra ottica e la collimazione delle ottiche, è stato riferito per passare da AR a OR PAM, rendendo difficile il processo di allineamento 30 . In tutti questi casi, AR-PAM non ha utilizzato l'illuminazione a campo scuro. L'utilizzo dell'illuminazione a campo scuro può ridurre la generazione di segnali fotoacoustici forti dalla superficie della pelle. Pertanto, l'imaging a tessuto profondo può essere eseguito usando l'illuminazione a forma di anello, in quanto la sensibilità di rilevazione dei segnali fotoacoustici profondi sarà maggiore rispetto a quella dell'illuminazione a campo luminoso.
Questo lavoro riporta un sistema di imaging AR e OR PAM (AR-OR-PAM) in grado di acquisire sia immagini ad alta risoluzione che imaging a tessuto profondo a bassa risoluzione dello stesso campione, utilizzando lo stesso laser e scanner per entrambi i sistemiems. Le prestazioni del sistema AR-OR-PAM sono state caratterizzate dalla determinazione della risoluzione spaziale e della profondità dell'immagine utilizzando esperimenti fantasma. La vascolarizzazione in vivo di sangue è stata eseguita su un orecchio del mouse per dimostrare la sua capacità biologica di imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
In conclusione, è stato sviluppato un sistema AR e OR PAM intercambiabile che consente di ottenere sia l'immagine ad alta risoluzione sia le profondità di imaging più basse e l'imaging a bassa risoluzione ad una profondità di imaging più elevata. È stata determinata la risoluzione laterale e la profondità dell'immagine del sistema commutabile. I vantaggi di questo sistema PAM commutabile includono: (1) l'imaging ad alta risoluzione con focus ottico stretto; (2) l'imaging del tessuto profondo c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno finanziario di una borsa di Tier 2 finanziata dal Ministero dell'Istruzione a Singapore (ARC2 / 15: M4020238). Gli autori ringraziano anche il signor Chow Wai Hoong Bobby per l'aiuto della macchina.
Materials
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
Riferimenti
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