Переключаемая акустическая и оптическая разрешающая фотоакустическая микроскопия для<em> В Виво</em> Масштабная картинка клеток
Summary
Показана возможность переключения системы акустического разрешения (AR) и оптической разрешающей (OR) фотоакустической микроскопии (AR-OR-PAM), которая позволяет получать изображения с высоким разрешением на мелкой глубине и глубокое изображение глубокой ткани с низким разрешением на одном и том же образце in vivo .
Abstract
Фотоакустическая микроскопия (PAM) – это быстрорастущая мода визуализации, которая сочетает в себе как оптику, так и ультразвук, обеспечивая проникновение за пределы оптической длины свободного пробега (~ 1 мм в коже) с высоким разрешением. Комбинируя контраст оптического поглощения с высоким пространственным разрешением ультразвука в одной модальности, этот метод может проникать в глубокие ткани. Системы фотоакустической микроскопии могут иметь низкое акустическое разрешение и зонд глубоко или высокое оптическое разрешение и зонд. Очень сложно добиться высокого пространственного разрешения и большого проникновения глубины с помощью единой системы. Эта работа представляет собой систему AR-OR-PAM, способную как с высоким разрешением, на мелкой глубине, так и с глубоким отображением глубокой ткани с низким разрешением одного и того же образца in vivo . Боковое разрешение 4 мкм с глубиной изображения 1,4 мм с использованием оптической фокусировки и боковое разрешение 45 мкм с глубиной изображения 7,8 мм с использованием акустической фокусировки были успешнымиПродемонстрированный с использованием комбинированной системы. Здесь, in vivo, визуализацию сосудистой сети животного мира проводят, чтобы продемонстрировать свою биологическую способность к визуализации.
Introduction
Модификации оптического изображения с высоким разрешением, такие как оптическая когерентная томография, конфокальная микроскопия и многофотонная микроскопия, имеют многочисленные преимущества. Однако пространственное разрешение значительно уменьшается по мере увеличения глубины изображения. Это связано с диффузным характером переноса света в мягких тканях 1 , 2 . Интеграция оптического возбуждения и ультразвукового обнаружения обеспечивает решение для преодоления проблемы оптической визуализации с высоким разрешением в глубоких тканях. Фотоакустическая микроскопия (PAM) – одна из таких модальностей, которая может обеспечить более глубокое изображение, чем другие оптические методы визуализации. Он успешно применяется для структурной, функциональной, молекулярной и клеточной визуализации in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 </sup> , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , объединив сильный контраст оптического поглощения с высоким пространственным разрешением от ультразвука.
В PAM короткий лазерный импульс облучает ткань / образец. Поглощение света хромофорами ( например, меланин, гемоглобин, вода и т. Д. ) Приводит к увеличению температуры, что, в свою очередь, приводит к образованию волн давления в виде волн акустики (фотоакустических волн). Сгенерированные фотоакустические волны могут быть обнаружены широкополосным ультразвуковым преобразователем вне границы ткани. Используя слабую оптическую и плотную акустическую фокусировку, глубокая тканная визуализация может быть достигнута в акустическом разрешении фотоакустической микроскопии (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . В AR-PAM, было показано поперечное разрешение 45 мкм и глубина изображения до 3 мм. 15 . Для того чтобы разрешить одиночные капилляры (~ 5 мкм) акустически, необходимы ультразвуковые преобразователи, работающие на частотах> 400 МГц. На таких высоких частотах глубина проникновения составляет менее 100 мкм. Проблема, вызванная плотной акустической фокусировкой, может быть решена с использованием плотной оптической фокусировки. Фотоакустическая микроскопия с оптическим разрешением (OR-PAM) способна разрешать одиночные капилляры или даже одну ячейку 17 , а латеральное разрешение 0,5 мкм было достигнуто 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Использование фотонного наноэлемента может помочь достичь разрешения, выходящего за пределы разрешающей способности дифракцииN 25 , 26 . В OR-PAM глубина проникновения ограничена из-за фокусировки света, и она может достигать до 1,2 мм внутри биологической ткани 23 . Таким образом, AR-PAM может изображение глубже, но с более низким разрешением, а OR-PAM может иметь изображение с очень высоким разрешением, но с ограниченной глубиной изображения. Скорость формирования изображения AR и OR-PAM в основном зависит от частоты повторения импульсов лазерного источника 27 .
Объединение AR-PAM и OR-PAM будет иметь большую выгоду для приложений, для которых требуется как высокое разрешение, так и более глубокое изображение. Были предприняты небольшие усилия для объединения этих систем. Обычно для визуализации используются два разных сканера изображения, что требует, чтобы образец перемещался между обеими системами, что затрудняло выполнение визуализации in vivo . Однако гибридное изображение с AR и OR PAM позволяет получать изображения с масштабируемыми разрешениямиЙ глубины. В одном подходе пучок оптических волокон используется для подачи света для AR и OR PAM. В этом подходе используются два отдельных лазера (высокоэнергетический лазер при 570 нм для AR и низкоэнергетический лазер с высокой частотой повторения при 532 нм для OR), что делает систему неудобной и дорогостоящей 28 . Длина волны лазера OR-PAM фиксирована, и многие исследования, такие как насыщение кислородом, невозможны с использованием этой комбинированной системы. Сравнительные исследования между AR и OR PAM также невозможны из-за разницы в длинах волн лазера между AR и OR. Кроме того, AR-PAM использует подсветку яркого поля; Следовательно, сильные фотоакустические сигналы с поверхности кожи ограничивают качество изображения. По этой причине система не может использоваться для многих приложений для биоизображения. В другом подходе к выполнению AR и OR PAM оптический и ультразвуковой фокус смещается, что делает фокус и фокусировку ультразвука неравнозначными. Таким образом, качество изображения не является оптимальным <suP class = "xref"> 29. Используя этот метод, AR-PAM и OR-PAM могут достичь только разрешений 139 мкм и 21 мкм соответственно, что делает его системой с низким разрешением. Сообщалось, что другой подход, который включает в себя изменение оптического волокна и коллимирующей оптики, переключается между AR и OR PAM, что затрудняет процесс выравнивания 30 . Во всех этих случаях AR-PAM не использовал подсветку темного поля. Использование освещения темного поля может уменьшить генерацию сильных фотоакустических сигналов с поверхности кожи. Поэтому глубокое изображение может быть выполнено с использованием кольцевой подсветки, поскольку чувствительность обнаружения глубоких фотоакустических сигналов будет более высокой, чем чувствительность яркого поля.
В этой работе сообщается о сменевой системе визуализации AR и OR PAM (AR-OR-PAM), способной получать изображения с высоким разрешением и изображения глубокой ткани с низким разрешением одного и того же образца, используя тот же лазер и сканер для обеих системЭмс. Производительность системы AR-OR-PAM характеризовалась определением пространственного разрешения и глубины изображения с использованием фантомных экспериментов. In vivo визуализация сосудистой сети крови проводилась на ухе мыши, чтобы продемонстрировать свою биологическую способность к визуализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
В заключение была разработана переключаемая система AR и OR PAM, которая позволяет получать изображения с высоким разрешением на более низких глубинах изображения и изображения с более низким разрешением на более высоких глубинах изображения. Определено боковое разрешение и глубина изо…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать финансовую поддержку гранта уровня 2, финансируемого Министерством образования в Сингапуре (ARC2 / 15: M4020238). Авторы также хотели бы поблагодарить г-на Чоу Вай Хоонга Бобби за помощь в механическом магазине.
Materials
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
Riferimenti
- Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
- Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
- Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
- Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
- Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
- Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
- Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
- Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
- Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
- Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
- Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
- Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
- Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
- Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
- Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
- Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006 (2014).
- Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
- Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
- Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
- Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
- Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
- Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
- Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic – resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
- Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
- Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
- . ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , (2000).
- Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).
