Articolo metodologico

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca

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DOI:

10.3791/55822

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19 maggio 2017

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1Department of Chemistry, Center of Diagnostics and Therapeutics (CDT), Georgia State University

In questo articolo

Sommario

Presentiamo protocolli per l'applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ .

Abstract

I transitori intracellulari di calcio (Ca 2+ ) evocati da stimoli extracellulari iniziano una moltitudine di processi biologici negli organismi viventi. Al centro del rilascio di calcio intracellulare sono i principali organici intracellulari di stoccaggio del calcio, il reticolo endoplasmatico (ER) e il reticolo sarcoplasmatico più specializzato (SR) nelle cellule muscolari. La liberazione dinamica del calcio da questi organelli è mediata dal recettore del ryanodine (RyR) e dall'inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3 R) con ricarico che si verificano attraverso la pompa sarco / endoplasmatica calcio ATPase (SERCA). Un sensore di calcio geneticamente codificato (GECI) chiamato CatchER è stato creato per monitorare il rilascio rapido del calcio dalla ER / SR. Ecco i protocolli dettagliati per la trasfezione e l'espressione del migliorato GECI CatchER + targeting ER / SR nelle cellule HEK293 e C2C12 e la sua applicazione nel monitoraggio del transitorio di calcio mediato dalla pompa IP 3 R, RyR e SERCAIn cellule HEK293 utilizzando microscopia a fluorescenza è descritto. L'agonista del recettore o l'inibitore della scelta è disperso nella soluzione della camera e i cambiamenti di intensità sono registrati in tempo reale. Con questo metodo si osserva una diminuzione del calcio ER con attivazione di RyR con 4-cloro-m-cresolo (4-cmc), l'attivazione indiretta di IP 3 R con adenosina trifosfato (ATP) e l'inibizione della pompa SERCA con ciclopiazonico Acido (CPA). Discutiamo anche i protocolli per la determinazione del K d in situ e la quantificazione basale [Ca 2+ ] nelle cellule C2C12. In sintesi, questi protocolli, usati in combinazione con CatchER + , possono elicitare il rilascio di calcio mediato dal recettore dalla ER con applicazione futura nello studio delle patologie correlate al calcio ER / SR.

Introduzione

Gli attributi spazio-temporali dei transitori intracellulari del calcio (Ca 2+ ) attivano varie funzioni biologiche 1 . Questi eventi di segnalazione Ca 2+ vengono scatenati extracellulari attraverso diversi stimoli e controllati intracellulariamente dalle principali organelle di stoccaggio Ca 2+ e da numerose Ca 2+ pompe, canali e proteine ​​leganti Ca 2+ . I transitori Ca 2+ possono essere alterati in modo significativo a causa di difetti con la modulazione del segnale, portando a diverse malattie 2 . A causa della velocità e dell'intricacy del sist....

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Protocollo

1. Preparazione delle diapositive

  1. Porre vetrini da microscopio da 22 mm x 40 mm in piatti da coltura a cellule da 6 cm, 1 vetrino per piatto.
  2. Esporre ogni lato di ciascuna diapositiva come pure il piatto da 6 cm a luce ultravioletta (UV) per 15-20 minuti per sterilizzare in un cappuccio sterile.
  3. Coprire i piatti con diapositive all'interno con parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l'uso.

2. Preparazione di supporti, buffers, soluzioni e reagenti

  1. Preparare 1 L di soluzione salina bilanciata Hank (HBSS) in acqua deionizzata e aggiungere 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO....

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Risultati

Questa sezione illustrerà i risultati ottenuti utilizzando i metodi precedentemente descritti usando il GECI CatchER + mirato ER / SR mirato per monitorare i cambiamenti in ER / SR Ca 2+ attraverso diversi percorsi mediati dal recettore.

La figura 1 illustra lo svuotamento ER attraverso il RyR stimolato con 200 μM di 4 cm. 4-cmc è un agonista del RyR. L'aggiunta del farma.......

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Discussione

L'imaging a cellule singole di sonde fluorescenti, come CatchER + , è una tecnica efficace per analizzare i processi di segnalazione intrinsecamente ER / SR Ca 2+ in ogni cellula in risposta a agonisti o antagonisti del recettore. Questa tecnica è utile anche per l'imaging utilizzando più lunghezze d'onda contemporaneamente, come è necessario per Fura-2 o per l'immagine CatchER + e Rhod-2 insieme per monitorare rispettivamente i cambiamenti di calcio ER e citosolici. Ci s.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant e un Supplemental Grant NIH a FR, borsa di BB a CM, borsa CDT a RG.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-cloro-3-metilfenolo (4-CmC)Sigma-AldrichC55402
515DCXR specchio dicroicoChroma Technology Corp.
Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idratoSigma-AldrichA26209
Cloruro di calcio diidratoEMD Millipore102382
Piastre di coltura trattate con coltura tissutale Corning (100 mm)Piastre di colturaSigma-AldrichCLS430167
Corning (60 mm)Sigma-AldrichCLS430166
Acido ciclopiazonico (CPA)EMD Millipore239805
D(+)-glucosioACROS Organics41095-0010
Dow Corning 111 Lubrificante per valvole & SigillanteWarner Instruments64-0275
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)Sigma-AldrichD7777
Ethylenebis(ossiethylenenitrilo)
acido tetraacetico (EGTA)		ACROS Organics409911000 
Siero Fetale Bovino (FBS)ThermoFisher26140087
Fisherbrand Copribicchieri 22x40 mmFisher Scientific  12-544B
Hanks Sali bilanciati (HBSS)Sigma-AldrichH4891
HEPES, acido libero, grado di biologia molecolareEMD Millipore391340
Olio da immersione senza autofluorescenzaLeica11513859
Ionomicina, acido liberoFisher Scientific50-230-5804
Leica DM6100B microscopio invertito con fotocamera EM-CCD raffreddataHamamatsuC9100-13
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000ThermoFisher11668019
Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015
Camera di imaging a bagno di diamante aperto a basso profiloWarner InstrumentsRC-26GLP
Cloruro di magnesio esaidratoFisher ScientificM33-500
Opti-MEMThermoFisher51985034
Cloruro di potassioEMD MilliporePX1405
Fosfato di potassio, EMD bibasicoMilliporePX1570
Fosfato di potassio,EMD monobasico MilliporePX1565
SaponinaSigma-Aldrich47036
SimplePCI Software di analisi delle immaginiHamamatsuN/A
Bicarbonato di sodioFisherScientific S233-3
Cloruro di sodioFisher ScientificS271-500
Sterivex-GV 0.22 µ m filterEMD MilliporeSVGVB1010
Till Polychrome V Lampada allo xenoTill PhotonicsN/A
Tripsina (2,5%), senza rosso fenolo (10x)ThermoFisher15090046
NC338059 trattate con coltura tissutale

Riferimenti

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  2. Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
  3. Tang, S., Reddish....

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CatchER Plusrilascio di calcio dal reticolo endoplasmaticomicroscopia a fluorescenzacellule HEK293cellule C2C12attivazione di IP3Rattivazione di RyRinibizione della pompa SERCAmisurazione dei transienti di calcioespressione del biosensore

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