JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biologia dello sviluppo

Lysmedieret reversibel modulering af den mitogenaktiverede proteinkinasevej under celledifferentiering og<em> Xenopus</em> Embryonudvikling

Published: June 15, 2017
doi:
10.3791/55823
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Denne protokol beskriver en optogenetisk strategi til modulering af mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) aktivitet under celledifferentiering og Xenopus embryonal udvikling. Denne metode muliggør reversibel aktivering af MAPK-signalvejen i pattedyrcellekultur og i multicellulære levende organismer, som Xenopus- embryoner, med høj rumlig og tidsmæssig opløsning.

Abstract

Kinaseaktivitet er afgørende for en overflod af cellulære funktioner, herunder celleproliferation, differentiering, migration og apoptose. Under tidlig embryonal udvikling er kinaseaktiviteten meget dynamisk og udbredt over embryoet. Farmakologiske og genetiske metoder anvendes almindeligt til at sonde kinaseaktiviteter. Desværre er det udfordrende at opnå en bedre rumlig og tidsmæssig opløsning ved hjælp af disse strategier. Endvidere er det ikke muligt at kontrollere kinasaktiviteten på en reversibel måde i levende celler og multicellulære organismer. En sådan begrænsning forbliver en flaskehals for at opnå en kvantitativ forståelse af kinaseaktivitet under udvikling og differentiering. Dette arbejde præsenterer en optogenetisk strategi, der udnytter et bicistronisk system, der indeholder fotoaktiverbare proteiner Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) og det N-terminale domæne i Cryptochrome-interaktive basic-helix-loop-helix (CIBN). ReversiBle-aktivering af den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) signalveje opnås gennem lysmedieret proteintranslokation i levende celler. Denne fremgangsmåde kan anvendes til pattedyrcellekulturer og levende hvirveldyrembryoner. Dette bicistroniske system kan generaliseres til at kontrollere aktiviteten af ​​andre kinaser med lignende aktiveringsmekanismer og kan anvendes til andre modelsystemer.

Introduction

Vækstfaktorer er involveret i et bredt spektrum af cellefunktioner, herunder proliferation, differentiering, migration og apoptose og spiller pivotale roller i mange biologiske hændelser, herunder embryonal udvikling, aldring og regulering af mental status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Mange vækstfaktorer signalerer gennem komplekse intracellulære signalkaskader. Disse signaleringshændelser drives ofte af reversibel proteinphosphorylering på en præcis reguleret måde 6 , 7 . Således er en forståelse af signaleringsresultaterne af proteinkinaser, som er ansvarlige for proteinphosphorylering, grundlæggende vigtig.

Forskellige vækstfaktorer virker gennem et ret almindeligt intracellulært signalnetværk, selv om de stimulerer distInkt cellulære responser 8 , 9 . Almindelige intracellulære mediatorer af receptortyrosinkinaser indbefatter Ras, Raf, ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK), mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) / ERK-kinase (MEK), phosphoinositid-3-kinase (PI3K), Akt og phospholipase C gamma (PLCy) 10 , 11 . Akkumulerende beviser tyder på, at signaleringsdiversitet og specificitet afhænger af rumlig og tidsmæssig regulering af signalaktivitet 12 . For eksempel aktiverer epidermal vækstfaktor (EGF) stimulering i rottefokromocytomceller (PC12), som resulterer i celleproliferation, transient aktiveringen af ​​ERK-pathway 9 . På den anden side aktiverer stimulering med nervevækstfaktor (NGF), som fører til celledifferentiering, aktiviteten af ​​ERK-vejen på en vedvarende måde 9 , 13 . I dyrkede rVed hippocampale neuroner fremmer transient signalering af hjerneafledt neurotrof faktor (BDNF) primær neuritudvækst, mens vedvarende signalering fører til øget neuritforgrening 14 . Under tidlig embryonal udvikling er phosphoryleret ERK-aktivitet temporalt dynamisk og er udbredt på tværs af embryoet 6 . En nylig genetisk skærm under tidlig Xenopus embryogenese viste, at ERK- og Akt-signaleringskaskader, to nedstrøms primære vækstfaktorveje, viser scenespecifikke aktiveringsprofiler 7 . En forståelse af kinasignaliseringsresultater kræver således værktøjer, der kan sonde de rumlige og tidsmæssige egenskaber ved kinaseaktivitet med tilstrækkelig opløsning.

Konventionelle eksperimentelle fremgangsmåder til at undersøge den dynamiske natur af signaltransduktion under udvikling mangler den ønskelige rumlige og tidsmæssige opløsning. F.eks. Udnytter farmakologiske fremgangsmåder lille kemIcal eller biologiske molekyler til at stimulere eller undertrykke signaltransduktion i celler og væv. Disse små molekylers diffusive natur gør det udfordrende at begrænse deres handling til en bestemt region af interesse 15 . Genetiske tilgange ( fx transgenese, Cre-Lox-systemet eller mutagenese) fører ofte til den irreversible aktivering eller undertrykkelse af målgenekspression eller proteinaktivitet 16 , 17 , 18 . Tet-On / Tet-Off-systemet 19 tilbyder forbedret temporal kontrol af gentranskription, men mangler streng rumlig kontrol, fordi den er afhængig af diffusionen af ​​tetracyclin. Nylige udviklinger i kemisk induceret proteindimerisering 20 eller foto-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 har kraftigt forbedringRedegjorde for den tidsmæssige kontrol af signalnetværk. Den rumlige kontrol forbliver dog udfordrende på grund af den diffusive karakter af de kendte kemikalier.

Nyligt fremkomne optogenetiske fremgangsmåder, som udnytter lysets evne til at kontrollere protein-protein-interaktioner, muliggør modulering af signalveje med høj spatiotemporal præcision såvel som reversibilitet. Kort efter sin oprindelige succes i styringen af ​​neuronfyring 25 , 26 , 27 er optogenetikum blevet udvidet til at kontrollere andre cellulære processer, såsom gentransskription, translation, celle-migration, differentiering og apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . En strategi der bruger pHotoaktiverbart proteinpar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) protein og det N-terminale domæne af kryptokrom-interagerende basic-helix-loop-helix (CIBN) blev for nylig udviklet til at kontrollere Rafl-kinaseaktivitet i pattedyrceller og Xenopus- embryoner 35 . CRY2 binder til CIBN ved blåt lys stimulering, og CRY2 / CIBN proteinkomplekset dissocierer spontant i mørket 34 . Blåt lys exciterer CRY2 cofactor, flavin adenin dinucleotid (FAD), hvilket fører til en konformationel ændring i CRY2 og dens efterfølgende binding til CIBN. Konstitutivt aktive (W374A) og flavin-deficiente (D387A) -mutanter af CRY2 kan fremstilles gennem mutationer i FAD-bindingslommen: CRY2 W374A- mutanten binder til CIBN uafhængig af lys, mens CRY2 D387A- mutanten ikke binder til CIBN under blå -lys stimulering 36 , 37 . Det optogenetiske system beskrevet iN denne protokol anvender vildtype CRY2 og CIBN til at inducere proteintranslokationsmedieret Raf1-aktivering i levende celler. Det er kendt, at membranrekruteringen af ​​Raf1 øger dens aktivitet 38 . I dette system er et tandem CIBN-modul forankret i plasmamembranen, og CRY2-mCherry er fusioneret til N-terminalen af ​​Raf1 35 . I mangel af blåt lys forbliver CRY2-mCherry-Raf1 i cytoplasmaet, og Raf1 er inaktivt. Blålys stimulering inducerer CRY2-CIBN binding og rekrutterer Raf1 til plasmamembranen, hvor Raf1 aktiveres. Rafaktivering stimulerer en Raf / MEK / ERK signaleringskaskade. Både CRY2- og CIBN-fusionsproteiner er kodet i et bicistronisk genetisk system. Denne strategi kan generaliseres til at kontrollere andre kinaser, såsom Akt, hvis aktiveringstilstand også kan tændes ved proteintranslokation i celler 39 . Dette arbejde præsenterer detaljerede protokoller til gennemførelse af denne optogenetiske strategi i pattedyrcellekultusRes og multicellular organismer.

Protocol

Animal forskning blev udført i overensstemmelse med retningslinjer fastsat af Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og University of Illinois Department of Animal Resources (DAR). 1. Optogenetisk Induktion af Protein Lokalisering i BHK21 Mammal Cell Cell Culture BEMÆRK: Trin 1.1-1.3 giver en metode til at samle et cellekulturkammer til billeddannelse med høje forstørrelsesmål ( f.eks. 63X eller 100X), som typisk har korte arbejd…

Representative Results

Ratiometrisk ekspression af fotoaktiverbare proteinpar: Figur 1A viser designet af en bicistronisk optogenetisk konstruktion, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (betegnet CRY2-2A-2CIBN) baseret på porcine teschovirum- 1 2A (P2A) peptid, som viser den højeste ribosom-skipping effektivitet blandt pattedyrcellelinier 42 . I tidligere arbejde er det blevet fastslået, at det optimale forhold for CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 er…

Discussion

Ved opbygning af lysboksen bør effekten af ​​de enkelte lysdioder måles. Baseret på tidligere erfaringer kan strømudgangen variere mellem individuelle lysdioder på grund af fremstillingsvarianter. Vælg et sæt lysdioder, der har en effekt inden for 10% af hinanden. Antallet af lysdioder, strømbegrænsende modstand og strømindgang kan ændres til forskellige typer cellekulturbeholdere ( f.eks. En 6-brønds eller 24-brønds plade). En 24 timer lysbelysning med en effekt på 0,2 mW / cm2 fremkalder ikk…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af University of Illinois i Urbana-Champaign (UIUC) og National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Materials

Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochimica. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Tags

Light-mediatedReversible ModulationMitogen-activated Protein Kinase PathwayCell DifferentiationXenopus Embryonic DevelopmentOptogenetic InductionCIBN-CRY2 InteractionFluorescence ImagingPHK21 CellsCRY2-mCherry-Raf1 Plasmid
check_url/it/55823?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image