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Biologia dello sviluppo

Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et<em> Xenopus</em> Développement embryonnaire

Published: June 15, 2017
doi:
10.3791/55823
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Ce protocole décrit une stratégie opto-génétique pour moduler l'activité de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire de Xenopus . Cette méthode permet l'activation réversible de la voie de signalisation MAPK dans la culture de cellules de mammifères et dans les organismes vivants multicellulaires, comme les embryons de Xenopus , avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Abstract

L'activité de la kinase est cruciale pour une pléthore de fonctions cellulaires, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, la migration et l'apoptose. Au début du développement embryonnaire, l'activité kinase est très dynamique et répandue dans l'embryon. Les approches pharmacologiques et génétiques sont couramment utilisées pour sondage des activités kinase. Malheureusement, il est difficile d'obtenir une résolution spatiale et temporelle supérieure en utilisant ces stratégies. En outre, il n'est pas possible de contrôler l'activité kinase de manière réversible dans les cellules vivantes et les organismes multicellulaires. Une telle limitation reste un goulet d'étranglement pour obtenir une compréhension quantitative de l'activité kinase pendant le développement et la différenciation. Ce travail présente une stratégie opto-génétique qui profite d'un système bicistronique contenant des protéines photoactivables Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) et le domaine N-terminal de l'hélice-hélice-hélice basique interagissant avec le cryptochrome (CIBN). ReversiL'activation de la voie de signalisation de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) est obtenue grâce à une translocation de protéines à médiation légère dans des cellules vivantes. Cette approche peut être appliquée aux cultures cellulaires de mammifères et aux embryons de vertébrés vivants. Ce système bicistronique peut être généralisé pour contrôler l'activité d'autres kinases avec des mécanismes d'activation similaires et peut être appliqué à d'autres systèmes modèles.

Introduction

Les facteurs de croissance sont impliqués dans un large éventail de fonctions cellulaires, y compris la prolifération, la différenciation, la migration et l'apoptose, et jouent un rôle central dans de nombreux événements biologiques, y compris le développement embryonnaire, le vieillissement et la régulation de l'état mental 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . De nombreux facteurs de croissance signalent des cascades de signalisation intracellulaire complexes. Ces événements de signalisation sont souvent opérés par la phosphorylation réversible des protéines de manière réglementée 6 , 7 . Ainsi, une compréhension des résultats de signalisation des protéines kinases, qui sont responsables de la phosphorylation des protéines, est fondamentalement importante.

Différents facteurs de croissance agissent à travers un réseau de signalisation intracellulaire assez fréquent, bien qu'ils stimulent distRéactions cellulaires internes 8 , 9 . Les médiateurs intracellulaires communs des tyrosine kinases réceptrices comprennent Ras, Raf, la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK), la protéine kinase activée par un mitogène (MAPK) / ERK kinase (MEK), la phosphoinositide 3-kinase (PI3K), l'Akt et la phospholipase C gamma (PLCγ) 10 , 11 . Les données recueillies suggèrent que la diversité et la spécificité de la signalisation dépendent de la régulation spatiale et temporelle de l'activité de signalisation 12 . Par exemple, dans les cellules de phéochromocytome de rat (PC12), la stimulation du facteur de croissance épidermique (EGF), qui entraîne une prolifération cellulaire, active de manière transitoire la voie ERK 9 . D'autre part, la stimulation avec le facteur de croissance nerveuse (NGF), qui conduit à la différenciation cellulaire, active la voie ERK de manière soutenue 9 , 13 . En cultureChez les neurones de l'hippocampe, la signalisation transitoire par le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) favorise l'essor primaire des neurites, tandis que la signalisation prolongée conduit à une augmentation de la dérivation des neurites 14 . Au début du développement embryonnaire, l'activité ERK phosphorylée est temporairement dynamique et est répandue dans l'embryon 6 . Un écran génétique récent lors de l'embryogenèse précoce de Xenopus a montré que les cascades de signalisation ERK et Akt, deux voies du facteur de croissance primaire en aval, affichent des profils d'activation spécifiques à l'étape 7 . Ainsi, une compréhension des résultats de la signalisation kinase nécessite des outils qui peuvent sonder les caractéristiques spatiales et temporelles de l'activité kinase avec une résolution suffisante.

Les approches expérimentales conventionnelles pour sonder la nature dynamique de la transduction du signal pendant le développement n'ont pas la résolution spatiale et temporelle souhaitable. Par exemple, les approches pharmacologiques utilisent une petite chemMolécules biologiques ou biologiques pour stimuler ou supprimer la transduction du signal dans les cellules et les tissus. La nature diffusive de ces petites molécules rend difficile de restreindre leur action à une région d'intérêt spécifique 15 . Les approches génétiques ( par exemple, la transgénèse, le système Cre-Lox ou la mutagenèse) conduisent souvent à une activation ou à une répression irréversible de l'expression du gène cible ou de l'activité protéique 16 , 17 , 18 . Le système Tet-On / Tet-Off 19 offre un contrôle temporel amélioré de la transcription des gènes mais manque de contrôle spatial strict car il repose sur la diffusion de la tetracycline. Les développements récents de la dimérisation des protéines chimiquement induites 20 ou des photos 21 , 22 , 23 , 24 ont considérablement amélioréLe contrôle temporel des réseaux de signalisation. Le contrôle spatial, cependant, reste difficile en raison de la nature diffusive des produits chimiques en cage.

Les approches optogénétiques émergentes récentes, qui exploitent la puissance de la lumière pour contrôler les interactions protéine-protéine, permettent la modulation des voies de signalisation avec une haute précision spatio-temporelle ainsi qu'une réversibilité. Peu après son succès initial dans le contrôle des tirs neuronaux 25 , 26 , 27 , l'optogenèse a été étendue pour contrôler d'autres processus cellulaires, tels que la transcription des gènes, la traduction, la migration cellulaire, la différenciation et l'apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Une stratégie utilisant la pLa combinaison de protéines hotoactivables La protéine de cryptochrome 2 d' Arabidopsis thaliana (CRY2) et le domaine N-terminal de l'hélice-boucle de base-hélice basique (CIBN) qui coopère avec le cryptochrome ont récemment été développés pour contrôler l'activité de Raf1 kinase dans des cellules de mammifères et des embryons de Xenopus 35 . CRY2 se lie à CIBN lors de la stimulation de la lumière bleue, et le complexe de protéines CRY2 / CIBN se dissocie spontanément dans l'obscurité 34 . La lumière bleue excite le cofacteur CRY2, le dinucléotide d'adénine de flavine (FAD), ce qui conduit à une modification conformationnelle de CRY2 et à sa liaison ultérieure à CIBN. Des mutants actifs actifs (W374A) et des déficients en flavine (D387A) de CRY2 peuvent être produits par des mutations dans la poche de liaison au FAD: le mutant CRY2 W374A se lie à CIBN indépendamment de la lumière, alors que le mutant CRY2 D387A ne se lie pas à la CIBN sous le bleu – stimulation lumineuse 36 , 37 . Le système opto-génétique décrit iN ce protocole utilise CRY2 et CIBN de type sauvage pour induire une activation de Raf1 médiée par translocation de protéines dans des cellules vivantes. On sait que le recrutement membranaire de Raf1 améliore son activité 38 . Dans ce système, un module tandem CIBN est ancré à la membrane plasma et CRY2-mCherry est fusionné à la N-terminal de Raf1 35 . En l'absence de lumière bleue, CRY2-mCherry-Raf1 reste dans le cytoplasme et Raf1 est inactif. La stimulation à la lumière bleue induit la liaison CRY2-CIBN et recrute Raf1 à la membrane plasmatique, où Raf1 est activé. L'activation de Raf stimule une cascade de signalisation Raf / MEK / ERK. Les protéines de fusion CRY2 et CIBN sont codées dans un système génétique bicistronique. Cette stratégie peut être généralisée pour contrôler d'autres kinases, telles que Akt, dont l'état d'activation peut également être activé par la translocation des protéines dans les cellules 39 . Ce travail présente des protocoles détaillés pour la mise en œuvre de cette stratégie optogénétique dans la culture de cellules de mammifèresRes et des organismes multicellulaires.

Protocol

La recherche sur les animaux a été menée conformément aux lignes directrices établies par le Comité de l'établissement et de l'alimentation en établissement des animaux de l'Illinois (IACUC) et le Département des ressources animales de l'Université de l'Illinois (DAR). 1. Induction optogénétique de la localisation des protéines dans la culture cellulaire de mammifères BHK21 REMARQUE: Les étapes 1.1-1.3 fournissent une méthode pou…

Representative Results

L'expression ratiométrique des paires de protéines photoactivables: la figure 1A montre la conception d'une construction optogénétique bicistronique, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (appelée CRY2-2A-2CIBN), basée sur le teschovirum porcine- 1 2A (P2A) peptide, qui montre l'efficacité de saut de ribosome le plus élevé parmi les lignées de cellules de mammifères 42 . Dans les travaux antérieurs, il a ét…

Discussion

Lors de la construction de la boîte à lumière, la puissance des LED individuelles doit être mesurée. Sur la base de l'expérience précédente, la puissance de sortie peut varier entre les LED individuelles en raison de la variance de fabrication. Sélectionnez un ensemble de LEDs ayant une puissance inférieure à 10% l'une de l'autre. Le nombre de diodes électroluminescentes, la résistance de limitation de courant et l'entrée de puissance peuvent être modifiés pour différents types de conten…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'Université de l'Illinois à Urbana-Champaign (UIUC) et les National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Materials

Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 
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Riferimenti

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochimica. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

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Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).
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