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Biologia dello sviluppo

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em> Xenopus</em> Embryonale Entwicklung

Published: June 15, 2017
doi:
10.3791/55823
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine optogenetische Strategie zur Modulation der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) Aktivität während der Zelldifferenzierung und der Xenopus embryonalen Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die reversible Aktivierung des MAPK-Signalwegs in der Säugerzellkultur und in multizellulären Lebendorganismen wie Xenopus- Embryonen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Abstract

Kinase-Aktivität ist entscheidend für eine Fülle von zellulären Funktionen, einschließlich Zellproliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose. Während der frühen embryonalen Entwicklung ist die Kinase-Aktivität hochdynamisch und weit verbreitet im Embryo. Pharmakologische und genetische Ansätze werden häufig verwendet, um Kinaseaktivitäten zu untersuchen. Leider ist es schwierig, mit diesen Strategien eine überlegene räumliche und zeitliche Auflösung zu erreichen. Weiterhin ist es nicht möglich, die Kinaseaktivität reversibel in lebenden Zellen und multizellulären Organismen zu kontrollieren. Eine solche Einschränkung bleibt ein Engpass für ein quantitatives Verständnis der Kinaseaktivität während der Entwicklung und Differenzierung. Diese Arbeit präsentiert eine optogenetische Strategie, die ein bicistronisches System mit photoaktivierbaren Proteinen Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) und der N-terminalen Domäne von Cryptochrom-interagierenden Basis-Helix-Loop-Helix (CIBN) nutzt. ReversiDie Aktivierung des mitogen-aktivierten Proteinkinase- (MAPK-) Signalisierungsweges wird durch lichtvermittelte Proteintranslokation in lebenden Zellen erreicht. Dieser Ansatz kann auf Säugetierzellkulturen angewendet werden und lebende Wirbeltierembryonen. Dieses bicistronische System kann verallgemeinert werden, um die Aktivität anderer Kinasen mit ähnlichen Aktivierungsmechanismen zu kontrollieren und kann auf andere Modellsysteme angewendet werden.

Introduction

Wachstumsfaktoren sind an einem breiten Spektrum von Zellfunktionen beteiligt, darunter Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose und spielen in vielen biologischen Ereignissen, einschließlich embryonaler Entwicklung, Alterung und Regulierung des mentalen Status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Viele Wachstumsfaktoren signalisieren durch komplexe intrazelluläre Signalkaskaden. Diese Signalisierungsereignisse werden oft durch reversible Proteinphosphorylierung präzise geregelt 6 , 7 betrieben. So ist ein Verständnis der Signalisierungsergebnisse von Proteinkinasen, die für die Proteinphosphorylierung verantwortlich sind, von grundlegender Bedeutung.

Unterschiedliche Wachstumsfaktoren wirken durch ein relativ häufiges intrazelluläres Signalisierungsnetzwerk, obwohl sie dist anregenInct zelluläre Reaktionen 8 , 9 . Häufige intrazelluläre Mediatoren von Rezeptortyrosinkinasen umfassen Ras, Raf, extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK), mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) / ERK-Kinase (MEK), Phosphoinositid-3-kinase (PI3K), Akt und Phospholipase C gamma (PLC & gamma;) 10 , 11 . Die akkumulierende Evidenz deutet darauf hin, dass die Signalisierungsvielfalt und die Spezifität von der räumlichen und zeitlichen Regulierung der Signalisierungsaktivität abhängen. Zum Beispiel aktiviert bei Ratten-Pheochromozytomzellen (PC12) die epidermale Wachstumsfaktor (EGF) -Stimulation, die zu einer Zellproliferation führt, den ERK-Weg 9 vorübergehend. Auf der anderen Seite aktiviert die Stimulation mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF), die zur Zelldifferenzierung führt, den ERK-Weg nachhaltig 9 , 13 . In kultivierten rBei hippocampalen Neuronen fördert die transiente Signalisierung durch den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophischen Faktor (BDNF) das primäre Neuritenwachstum, während die anhaltende Signalisierung zu einer erhöhten Neuritenverzweigung führt. Während der frühen embryonalen Entwicklung ist die phosphorylierte ERK-Aktivität zeitlich dynamisch und weit verbreitet im Embryo 6 . Ein aktueller genetischer Screen während der frühen Xenopus- Embryogenese zeigte, dass ERK- und Akt-Signalkaskaden, zwei nachgeschaltete primäre Wachstumsfaktorwege, bühnenspezifische Aktivierungsprofile zeigen 7 . So verlangt ein Verständnis der Kinase-Signalisierungsergebnisse Werkzeuge, die die räumlichen und zeitlichen Merkmale der Kinaseaktivität mit ausreichender Auflösung untersuchen können.

Konventionelle experimentelle Ansätze, die dynamische Natur der Signaltransduktion während der Entwicklung zu untersuchen, fehlt der wünschenswerten räumlichen und zeitlichen Auflösung. Zum Beispiel verwenden pharmakologische Ansätze kleine chemIcal oder biologischen Molekülen zur Stimulierung oder Unterdrückung der Signaltransduktion in Zellen und Geweben. Die diffuse Natur dieser kleinen Moleküle macht es schwierig, ihre Handlung auf eine bestimmte Region von Interesse zu beschränken 15 . Genetische Ansätze ( zB Transgenese, Cre-Lox-System oder Mutagenese) führen häufig zur irreversiblen Aktivierung oder Repression der Zielgenexpression bzw. Proteinaktivität 16 , 17 , 18 . Das Tet-On / Tet-Off-System 19 bietet eine verbesserte zeitliche Kontrolle der Gentranskription, aber es fehlt eine strikte räumliche Kontrolle, da es auf der Diffusion von Tetracyclin beruht. Jüngste Entwicklungen in der chemisch induzierten Proteindimerisierung 20 oder photo-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 haben stark verbessertDie zeitliche Steuerung von Signalisierungsnetzwerken. Die räumliche Kontrolle bleibt jedoch aufgrund der diffusen Beschaffenheit der eingesperrten Chemikalien anspruchsvoll.

Jüngste aufkommende optogenetische Ansätze, die die Kraft des Lichts nutzen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu kontrollieren, erlauben die Modulation von Signalwegen mit hoher räumlich-zeitlicher Präzision sowie Reversibilität. Kurz nach ihrem anfänglichen Erfolg bei der Kontrolle des neuronalen Brennens 25 , 26 , 27 wurde die Optogenetik erweitert, um andere zelluläre Prozesse wie die Gentranskription, Translation, Zellmigration, Differenzierung und Apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 zu kontrollieren , 34 . Eine Strategie mit dem pHotoaktivierbares Proteinpaar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) -Protein und die N-terminale Domäne von Cryptochrom-interagierenden Basic-Helix-Loop-Helix (CIBN) wurde kürzlich entwickelt, um die Raf1-Kinase-Aktivität in Säugetierzellen und Xenopus- Embryonen 35 zu kontrollieren. CRY2 bindet an CIBN bei Blue-Light-Stimulation, und der CRY2 / CIBN-Proteinkomplex dissoziiert spontan im Dunkeln 34 . Blaues Licht erregt den CRY2-Cofaktor, Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), was zu einer Konformationsänderung in CRY2 und dessen anschließender Bindung an CIBN führt. Konstitutiv aktive (W374A) und Flavin-defiziente (D387A) -Mutanten von CRY2 können durch Mutationen in der FAD-Bindungstasche produziert werden : Die CRY2 W374A- Mutante bindet an CIBN unabhängig von Licht, während die CRY2 D387A- Mutante nicht an CIBN unter blau bindet Leichte Stimulation 36 , 37 . Das optogenetische System beschrieben iN dieses Protokoll verwendet Wildtyp-CRY2 und CIBN, um die Protein-Translokation-vermittelte Raf1-Aktivierung in lebenden Zellen zu induzieren. Es ist bekannt, dass die Membranrekrutierung von Raf1 seine Aktivität verstärkt. In diesem System ist ein Tandem-CIBN-Modul an der Plasmamembran verankert und CRY2-mCherry ist an den N-Terminus von Raf1 35 fusioniert. In Abwesenheit von blauem Licht bleibt CRY2-mCherry-Raf1 im Zytoplasma und Raf1 ist inaktiv. Die Blaulichtstimulation induziert die CRY2-CIBN-Bindung und rekrutiert Raf1 an die Plasmamembran, wo Raf1 aktiviert wird. Die Raf-Aktivierung stimuliert eine Raf / MEK / ERK-Signalkaskade. Sowohl CRY2- als auch CIBN-Fusionsproteine ​​sind in einem bikistronischen genetischen System codiert. Diese Strategie kann verallgemeinert werden, um andere Kinasen, wie zB Akt, zu kontrollieren, deren Aktivierungszustand auch durch Protein-Translokation in Zellen 39 eingeschaltet werden kann. Diese Arbeit stellt detaillierte Protokolle für die Umsetzung dieser optogenetischen Strategie in Säugetierzellkultur darRes und multizellulären Organismen.

Protocol

Die Tierforschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und der University of Illinois Department of Animal Resources (DAR) durchgeführt. 1. Optogenetische Induktion der Protein-Lokalisation in BHK21 Säugetierzellkultur HINWEIS: Die Schritte 1.1-1.3 stellen eine Methode zur Zusammenstellung einer Zellkulturkammer zur Bildgebung mit hochvergrößerten Objektiven ( zB 63X oder 100X) z…

Representative Results

Ratiometrische Expression von photoaktivierbaren Proteinpaaren: Abbildung 1A zeigt den Entwurf eines bicistronischen optogenetischen Konstrukts, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (bezeichnet als CRY2-2A-2CIBN), basierend auf dem Schweine-Teschovirum- 1 2A (P2A) -Peptid, das die höchste Ribosomen-überspringende Effizienz unter den Säugerzelllinien 42 zeigt . In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass das optimale Verhält…

Discussion

Beim Bau des Lichtkastens sollte die Leistung einzelner LEDs gemessen werden. Basierend auf bisherigen Erfahrungen kann die Leistung zwischen einzelnen LEDs aufgrund der Fertigungsvarianz variieren. Wählen Sie einen Satz von LEDs, die eine Leistungsabgabe innerhalb von 10% voneinander haben. Die Anzahl der LEDs, der Strombegrenzungswiderstand und die Leistungsaufnahme können für verschiedene Arten von Zellkulturbehältern ( zB eine 6-Well- oder 24-Well-Platte) modifiziert werden. Eine 24 h Lichtbeleuchtung b…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der University of Illinois bei Urbana-Champaign (UIUC) und den National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816) unterstützt.

Materials

Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 
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Riferimenti

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Keywords: Light-mediatedReversible ModulationMitogen-activated Protein Kinase PathwayCell DifferentiationXenopus Embryonic DevelopmentOptogenetic InductionCIBN-CRY2 InteractionFluorescence ImagingPHK21 CellsCRY2-mCherry-Raf1 Plasmid
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Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).
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