JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biologia dello sviluppo

Lysmediert reversibel modulering av den mitogenaktiverte proteinkinaseveien under celledifferensiering og<em> Xenopus</em> Embryonutvikling

Published: June 15, 2017
doi:
10.3791/55823
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Denne protokollen beskriver en optogenetisk strategi for å modulere mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) aktivitet under celledifferensiering og utvikling av Xenopus embryon. Denne metoden tillater reversibel aktivering av MAPK-signalveien i pattedyrcellekultur og i multicellulære levende organismer, som Xenopus- embryoer, med høy romlig og tidsmessig oppløsning.

Abstract

Kinaseaktivitet er avgjørende for en rekke cellulære funksjoner, inkludert celleproliferasjon, differensiering, migrasjon og apoptose. Under tidlig embryonal utvikling er kinaseaktiviteten svært dynamisk og utbredt over embryoet. Farmakologiske og genetiske tilnærminger blir ofte brukt til å undersøke kinasaktivitetene. Dessverre er det utfordrende å oppnå overlegen romlig og tidsmessig oppløsning ved hjelp av disse strategiene. Videre er det ikke mulig å kontrollere kinasaktiviteten på reversibel måte i levende celler og multicellulære organismer. En slik begrensning forblir en flaskehals for å oppnå en kvantitativ forståelse av kinaseaktivitet under utvikling og differensiering. Dette arbeidet presenterer en optogenetisk strategi som utnytter et bicistronisk system som inneholder fotoaktiverbare proteiner Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) og det N-terminale domenet til kryptokrom-interaksjonen med basis-helix-loop-helix (CIBN). ReversiBle aktivering av mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) signalvei oppnås gjennom lysmediert proteintranslokasjon i levende celler. Denne tilnærmingen kan anvendes på pattedyrcellekulturer og levende vertebratembryoer. Dette bicistroniske systemet kan generaliseres for å kontrollere aktiviteten til andre kinaser med lignende aktiveringsmekanismer og kan brukes på andre modellsystemer.

Introduction

Vekstfaktorer er involvert i et bredt spekter av cellefunksjoner, inkludert spredning, differensiering, migrasjon og apoptose, og spiller sentrale roller i mange biologiske hendelser, inkludert embryonal utvikling, aldring og regulering av mental status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Mange vekstfaktorer signalerer gjennom komplekse intracellulære signalkaskader. Disse signaleringshendelsene drives ofte av reversibel proteinfosforylering på nøyaktig regulert måte 6 , 7 . Dermed er en forståelse av signaleringsutfallene av proteinkinaser, som er ansvarlige for proteinfosforylering, fundamentalt viktig.

Ulike vekstfaktorer virker gjennom et ganske vanlig intracellulært signalnettverk, selv om de stimulerer distInktcellulære responser 8 , 9 . Vanlige intracellulære mediatorer av reseptortyrosinkinaser inkluderer Ras, Raf, ekstracellulær signalregulert kinase (ERK), mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) / ERK-kinase (MEK), fosfonositid-3-kinase (PI3K), Akt og fosfolipase C gamma (PLCy) 10 , 11 . Akkumulerende bevis antyder at signaleringsdiversitet og spesifisitet er avhengig av romlig og tidsmessig regulering av signalaktivitet 12 . For eksempel aktiverer stimulering av epidermal vekstfaktor (EGF) i rottefeokromocytomceller (PC12), som resulterer i celleproliferasjon, forbigående forbigående ERK-vei 9 . På den annen side aktiverer stimulering med nervevækstfaktor (NGF), som fører til celle-differensiering, ERK-banen på en vedvarende måte 9 , 13 . I dyrkede rVed hippokampale nevroner, fremmer transient signalering av hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) primær neurittutvækst, mens vedvarende signalering fører til økt nevitforgrening 14 . Under tidlig embryonal utvikling er fosforylert ERK-aktivitet temporalt dynamisk og er utbredt over embryoet 6 . En nylig genetisk skjerm under tidlig Xenopus- embryogenese viste at ERK- og Akt-signaleringskaskader, to nedstrøms primære vekstfaktorbaner, viser scenespesifikke aktiveringsprofiler 7 . En forståelse av kinasasignalutfallet krever således verktøy som kan teste de romlige og tidsmessige egenskapene til kinaseaktivitet med tilstrekkelig oppløsning.

Konvensjonelle eksperimentelle tilnærminger for å undersøke den dynamiske naturen til signaltransduksjon under utvikling mangler den ønskelige romlige og tidsmessige oppløsning. For eksempel, farmakologiske tilnærminger utnytte liten kjemIcal eller biologiske molekyler for å stimulere eller undertrykke signaltransduksjon i celler og vev. Den diffusive naturen til disse små molekylene gjør det utfordrende å begrense deres handling til en bestemt region av interesse 15 . Genetiske tilnærminger ( f.eks. Transgenese, Cre-Lox-systemet eller mutagenese) fører ofte til irreversibel aktivering eller undertrykkelse av målgenuttrykk eller proteinaktivitet 16 , 17 , 18 . Tet-On / Tet-Off-systemet 19 gir forbedret temporal kontroll av gentranskripsjon, men mangler streng romlig kontroll fordi den er avhengig av diffusjon av tetracyklin. Nylige utviklinger i kjemisk indusert proteindimerisering 20 eller foto-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 har betydelig forbedringReddet den tidsmessige kontrollen av signalnettverk. Den romlige kontrollen forblir imidlertid utfordrende på grunn av den diffusive naturen av de kaste kjemikaliene.

Nylige fremvoksende optogenetiske tilnærminger, som utnytter lysets kraft til å kontrollere protein-protein-interaksjoner, tillater modulering av signalveier med høy spatiotemporal presisjon samt reversibilitet. Kort tid etter den første suksess i kontroll av nevronbrann 25 , 26 , 27 , har optogenetikk blitt utvidet til å kontrollere andre cellulære prosesser, som gentranskripsjon, oversettelse, cellemigrasjon, differensiering og apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . En strategi som bruker pHotoaktiverbart proteinpar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) protein og det N-terminale domenet til kryptokrom-interaksjon-basisk helix-loop-helix (CIBN) ble nylig utviklet for å kontrollere Raf1-kinaseaktivitet i pattedyrceller og Xenopus- embryoer 35 . CRY2 binder til CIBN ved blått lysstimulering, og CRY2 / CIBN-proteinkomplekset dissocierer spontant i mørket 34 . Blått lys excites CRY2 cofactor, flavin adenine dinucleotide (FAD), som fører til en konformasjonell endring i CRY2 og dens påfølgende binding til CIBN. Konstitutivt aktive (W374A) og flavin-mangelfulle (D387A) mutanter av CRY2 kan fremstilles ved mutasjoner i FAD-bindingslommen: CRY2 W374A- mutanten binder til CIBN uavhengig av lys, mens CRY2 D387A- mutanten ikke binder til CIBN under blå -lys stimulering 36 , 37 . Det optogenetiske systemet beskrevet iN denne protokollen bruker wild-type CRY2 og CIBN for å inducere protein-translokasjons-mediert Raf1-aktivering i levende celler. Det er kjent at membranrekruttering av Raf1 øker sin aktivitet 38 . I dette systemet er en tandem CIBN-modul forankret i plasmamembranen, og CRY2-mCherry er fusjonert til N-terminalen til Raf1 35 . I fravær av blått lys forblir CRY2-mCherry-Raf1 i cytoplasma, og Raf1 er inaktiv. Blålysstimulering induserer CRY2-CIBN-binding og rekrutterer Raf1 til plasmamembranen, hvor Raf1 er aktivert. Rafaktivering stimulerer en Raf / MEK / ERK signaleringskaskade. Både CRY2- og CIBN-fusjonsproteiner er kodet i et bikistronisk genetisk system. Denne strategien kan generaliseres for å kontrollere andre kinaser, for eksempel Akt, hvis aktiveringstilstand også kan bli slått på ved proteinoverføring i celler 39 . Dette arbeidet presenterer detaljerte protokoller for implementering av denne optogenetiske strategien i pattedyrcellekultusRes og multicellular organismer.

Protocol

Dyrforskning ble gjennomført i samsvar med retningslinjer fastsatt av Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og University of Illinois Department of Animal Resources (DAR). 1. Optogenetic Induksjon av Protein Lokalisering i BHK21 Mammalian Cell Culture MERK: Trinn 1.1-1.3 gir en metode for å montere et cellekulturkammer for avbildning med høy forstørrelsesmål ( f.eks. 63X eller 100X), som vanligvis har korte arbeidsavstander. Dis…

Representative Results

Ratiometrisk uttrykk for fotoaktiverbare proteinpar: Figur 1A viser utformingen av en bicistronisk optogenetisk konstruksjon, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (referert til som CRY2-2A-2CIBN), basert på porcine teschovirum- 1 2A (P2A) peptid, som viser den høyeste ribosom-hoppende effektiviteten blant pattedyrcellelinjer 42 . I tidligere arbeid har det blitt fastslått at det optimale forholdet for CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherr…

Discussion

Når lysboksen bygges, må effekten til individuelle lysdioder måles. Basert på tidligere erfaring kan effekten variere mellom individuelle lysdioder på grunn av produksjonsvariasjon. Velg et sett med lysdioder som har en effekt på 10% av hverandre. Antall lysdioder, strømbegrensende motstand og strøminngang kan modifiseres for forskjellige typer cellekulturbeholdere ( f.eks. En 6-brønn eller 24-brønn plate). En 24 t lysbelysning med en effekt på 0,2 mW / cm2 fremkaller ikke detekterbar fototoxicitet <…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av University of Illinois i Urbana-Champaign (UIUC) og National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Materials

Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochimica. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Tags

Light-mediatedReversible ModulationMitogen-activated Protein Kinase PathwayCell DifferentiationXenopus Embryonic DevelopmentOptogenetic InductionCIBN-CRY2 InteractionFluorescence ImagingPHK21 CellsCRY2-mCherry-Raf1 Plasmid
check_url/it/55823?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image