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Biologia dello sviluppo

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e Xenopus Desenvolvimento embrionário

Published: June 15, 2017
doi:
10.3791/55823
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Este protocolo descreve uma estratégia optogenética para modular a atividade da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário de Xenopus . Este método permite a ativação reversível da via de sinalização MAPK na cultura de células de mamíferos e em organismos vivos multicelulares, como embriões Xenopus , com alta resolução espacial e temporal.

Abstract

A atividade da cinase é crucial para uma infinidade de funções celulares, incluindo proliferação celular, diferenciação, migração e apoptose. Durante o desenvolvimento embrionário precoce, a atividade quinasa é altamente dinâmica e generalizada em todo o embrião. As abordagens farmacológicas e genéticas são comumente usadas para sondar atividades de quinase. Infelizmente, é desafiador alcançar uma resolução espacial e temporal superior usando essas estratégias. Além disso, não é viável controlar a atividade quinasa de forma reversível em células vivas e organismos multicelulares. Essa limitação continua a ser um gargalo para alcançar uma compreensão quantitativa da atividade quinasa durante o desenvolvimento e a diferenciação. Este trabalho apresenta uma estratégia optogenética que tira proveito de um sistema bicistrônico contendo proteínas fotoativáveis Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) e o domínio N-terminal da híbrida-hélice-hélice básica interativa criptocromo (CIBN). ReversiA ativação da ativação da via de sinalização da proteína quinase ativada por mitogeno (MAPK) é conseguida através da translocação da proteína mediada por luz em células vivas. Esta abordagem pode ser aplicada a culturas de células de mamíferos e embriões de vertebrados vivos. Este sistema bicistrônico pode ser generalizado para controlar a atividade de outras quinases com mecanismos de ativação semelhantes e pode ser aplicado a outros sistemas modelo.

Introduction

Os fatores de crescimento estão envolvidos em um amplo espectro de funções celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração e apoptose, e desempenham papéis fundamentais em muitos eventos biológicos, incluindo desenvolvimento embrionário, envelhecimento e regulação do estado mental 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Muitos fatores de crescimento indicam através de cascatas de sinalização intracelular complexas. Esses eventos de sinalização são freqüentemente operados por fosforilação protéica reversível de forma regulada com precisão 6 , 7 . Assim, uma compreensão dos resultados de sinalização das proteínas quinases, que são responsáveis ​​pela fosforilação de proteínas, é fundamentalmente importante.

Diferentes fatores de crescimento agem através de uma rede de sinalização intracelular bastante comum, embora estimulem distInct celular respostas 8 , 9 . Os mediadores intracelulares comuns das tirosina cinases receptoras incluem Ras, Raf, cinase regulada por sinal extracelular (ERK), proteína quinase activada por mitogeno (MAPK) / ERK quinase (MEK), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Akt e fosfolipase C gama (PLCγ) 10 , 11 . A evidência de acumulação sugere que a diversidade e a especificidade da sinalização dependem da regulação espacial e temporal da atividade de sinalização 12 . Por exemplo, em células de feocromocitoma de ratos (PC12), a estimulação do fator de crescimento epidérmico (EGF), que resulta na proliferação celular, ativa a via ERK 9 transitória. Por outro lado, a estimulação com o fator de crescimento nervoso (NGF), que leva à diferenciação celular, ativa a via ERK de forma sustentada 9 , 13 . Em culturaNos neurônios do hipocampo, a sinalização transitória por fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) promove a proliferação primária dos neurites, enquanto a sinalização sustentada leva ao aumento da ramificação dos neurites 14 . Durante o desenvolvimento embrionário precoce, a atividade ERK fosforilada é temporariamente dinâmica e está disseminada em todo o embrião 6 . Uma tela genética recente durante a embriogênese precoce de Xenopus mostrou que as cascatas de sinalização de ERK e Akt, duas vias do factor de crescimento primário a jusante, exibiam os perfis de ativação específicos do estágio 7 . Assim, uma compreensão dos resultados da sinalização da quinase requer ferramentas que possam investigar as características espaciais e temporais da atividade quinasa com resolução suficiente.

As abordagens experimentais convencionais para investigar a natureza dinâmica da transdução de sinal durante o desenvolvimento não possuem a resolução espacial e temporal desejável. Por exemplo, as abordagens farmacológicas utilizamMoléculas histológicas ou biológicas para estimular ou suprimir a transdução de sinal em células e tecidos. A natureza difusiva dessas moléculas pequenas torna desafiador restringir sua ação a uma região específica de interesse 15 . As abordagens genéticas ( por exemplo, transgênese, sistema Cre-Lox ou mutagênese) geralmente levam à ativação ou à repressão irreversível da expressão do gene alvo ou da atividade protéica 16 , 17 , 18 . O sistema Tet-On / Tet-Off 19 oferece um controle temporal melhorado da transcrição genética, mas não possui controle espacial rigoroso porque depende da difusão da tetraciclina. Desenvolvimentos recentes na dimerização de proteína induzida quimicamente 20 ou foto-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 aumentaram bastanteO controle temporal das redes de sinalização. O controle espacial, no entanto, continua desafiando devido à natureza difusiva dos produtos químicos enjaulados.

As recentes abordagens optogenéticas emergentes, que aproveitam o poder da luz para controlar as interações proteína-proteína, permitem a modulação de caminhos de sinalização com alta precisão espaciotemporal e reversibilidade. Pouco depois do seu sucesso inicial no controle do disparo neuronal 25 , 26 , 27 , a optogenética foi estendida para controlar outros processos celulares, como transcrição de genes, tradução, migração celular, diferenciação e apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Uma estratégia usando a pO pino proteico de hotoactividade da proteína Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) e o domínio N-terminal da hélice-laço-hélice básica (CIBN) que interage criptocromo foi recentemente desenvolvido para controlar a atividade da quinase Raf1 em células de mamíferos e embriões Xenopus 35 . CRY2 liga-se a CIBN após a estimulação de luz azul e o complexo de proteína CRY2 / CIBN dissocia espontaneamente no escuro 34 . A luz azul excita o cofactor CRY2, o dinucleótido de flavina adenina (FAD), o que leva a uma mudança conformacional em CRY2 e sua subsequente ligação à CIBN. Os mutantes de CRY2 deficientes em flavina (D387A) podem ser produzidos através de mutações no bolso de ligação ao FAD: o mutante CRY2 W374A liga-se a CIBN independentemente da luz, enquanto que o mutante CRY2 D387A não se liga à CIBN sob o azul Estimulação luminosa 36 , 37 . O sistema optogenético descrito iN este protocolo usa CRY2 e CIBN de tipo selvagem para induzir ativação Raf1 mediada por translocação de proteínas em células vivas. Sabe-se que o recrutamento de membranas de Raf1 aumenta sua atividade 38 . Neste sistema, um módulo CIBN em tandem é ancorado na membrana plasmática e CRY2-mCherry é fundido com o N-terminal de Raf1 35 . Na ausência de luz azul, CRY2-mCherry-Raf1 permanece no citoplasma e Raf1 está inativo. A estimulação de luz azul induz a ligação CRY2-CIBN e recruta Raf1 para a membrana plasmática, onde Raf1 é ativado. A ativação do Raf estimula uma cascata de sinalização Raf / MEK / ERK. As proteínas de fusão CRY2 e CIBN são codificadas em um sistema genético bicistrônico. Essa estratégia pode ser generalizada para controlar outras quinases, como Akt, cujo estado de ativação também pode ser ativado pela translocação de proteínas nas células 39 . Este trabalho apresenta protocolos detalhados para implementar esta estratégia optogenética em cultu de células de mamíferosRes e organismos multicelulares.

Protocol

A pesquisa com animais foi conduzida de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais de Illinois (IACUC) e pelo Departamento de Recursos Animais da Universidade de Illinois (DAR). 1. Indução optogenética da localização de proteínas na cultura celular BHK21 de mamífero NOTA: As etapas 1.1-1.3 fornecem um método para montar uma câmara de cultura celular para imagens com objetivos de alta ampliação ( po…

Representative Results

Expressão raatiométrica de pares de proteínas fotoativáveis: a Figura 1A mostra o projeto de uma construção optogenética bicistrônica, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (referido como CRY2-2A-2CIBN), com base no teschovirum porcino- 1 péptido 2A (P2A), que mostra a maior eficiência de picos de ribossoma entre as linhas celulares de mamíferos 42 . No trabalho anterior, determinou-se que a razão ideal para CIBN-GFP-Ca…

Discussion

Ao construir a caixa de luz, a potência dos LEDs individuais deve ser medida. Com base na experiência anterior, a potência pode variar entre LEDs individuais devido a variação de fabricação. Selecione um conjunto de LEDs que tenham uma saída de energia dentro de 10% uns dos outros. O número de LEDs, o resistor de limitação de corrente e a entrada de energia podem ser modificados para diferentes tipos de recipientes de cultura celular ( por exemplo, uma placa de 6 poços ou de 24 poços). Uma ilumina?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Illinois em Urbana-Champaign (UIUC) e os Institutos Nacionais de Saúde (NIGMS R01GM111816).

Materials

Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 
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Riferimenti

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Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).
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