JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Светосвязная реверсивная модуляция митоген-активированного пути протеинкиназы при дифференцировке клеток и<em> Xenopus</em> Эмбриональное развитие

Published: June 15, 2017
doi:
10.3791/55823
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Этот протокол описывает оптигетную стратегию модуляции активности митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) во время клеточной дифференцировки и эмбрионального развития Xenopus . Этот метод позволяет обратимую активацию сигнального пути MAPK в культуре клеток млекопитающих и в многоклеточных живых организмах, таких как эмбрионы Xenopus , с высоким пространственным и временным разрешением.

Abstract

Киназная активность имеет решающее значение для множества клеточных функций, включая пролиферацию клеток, дифференцировку, миграцию и апоптоз. Во время раннего эмбрионального развития киназная активность очень динамична и широко распространена у эмбрионов. Фармакологические и генетические подходы обычно используются для исследования киназной активности. К сожалению, с помощью этих стратегий сложно достичь превосходного пространственного и временного разрешения. Кроме того, невозможно контролировать активность киназы обратимым образом в живых клетках и многоклеточных организмах. Такое ограничение остается узким местом для достижения количественного понимания активности киназы во время развития и дифференциации. В этой работе представлена ​​оптогенетическая стратегия, в которой используется бицистронная система, содержащая фотоактивируемые белки Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) и N-концевой домен взаимодействующей с криптохром базовой спиральной спиральной спирали (CIBN). Реверси(MAPK) сигнальный путь достигается через посредство световой опосредованной транслокации белка в живых клетках. Такой подход может быть применен к культурам клеток млекопитающих и эмбрионам живых позвоночных. Эта бицистронная система может быть обобщена для контроля активности других киназ с аналогичными механизмами активации и может быть применена к другим модельным системам.

Introduction

Факторы роста участвуют в широком спектре клеточных функций, включая пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз, играют ключевую роль во многих биологических событиях, включая эмбриональное развитие, старение и регуляцию психического статуса 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Многие факторы роста сигнализируют через сложные внутриклеточные сигнальные каскады. Эти сигнальные события часто управляются обратимым фосфорилированием белка точно регулируемым способом 6 , 7 . Таким образом, понимание сигнальных исходов протеинкиназ, ответственных за фосфорилирование белка, принципиально важно.

Различные факторы роста действуют через довольно распространенную внутриклеточную сигнальную сеть, хотя они стимулируют distInct сотовые ответы 8 , 9 . Обычные внутриклеточные медиаторы рецепторных тирозинкиназ включают Ras, Raf, внеклеточную сигнально-регулируемую киназу (ERK), митоген-активированную протеинкиназу (MAPK) / ERK-киназу (MEK), фосфоинозитид-3-киназу (PI3K), Akt и фосфолипазу C гамма (PLCγ) 10 , 11 . Накопление данных свидетельствует о том, что различение сигналов и их специфичность зависят от пространственного и временного регулирования сигнальной активности 12 . Например, в клетках феохромоцитомы крысы (PC12) стимуляция эпидермального фактора роста (EGF), которая приводит к пролиферации клеток, временно активирует путь ERK 9 . С другой стороны, стимуляция фактором роста нервов (NGF), который приводит к дифференциации клеток, активирует ERK-путь устойчивым образом 9 , 13 . В культуре rУ нейронов гиппокампа переходная сигнализация с помощью нейротрофического фактора мозга (BDNF) способствует первичному вырождению нейритов, в то время как устойчивая сигнализация приводит к увеличению разветвления нейритов 14 . Во время раннего эмбрионального развития фосфорилированная активность ERK является временной динамикой и широко распространена у эмбриона 6 . Недавний генетический экран во время раннего эмбриогенеза Xenopus показал, что каскады сигнализации ERK и Akt, два пучка первичных факторов роста ниже по течению, отображают специфические профили активации 7 . Таким образом, понимание результатов передачи киназы требует инструментов, которые могут определять пространственные и временные особенности киназной активности с достаточным разрешением.

Обычные экспериментальные подходы к исследованию динамического характера передачи сигнала во время развития не имеют желаемого пространственного и временного разрешения. Например, в фармакологических подходах используется небольшая химияИли биологические молекулы для стимуляции или подавления трансдукции сигнала в клетках и тканях. Диффузионный характер этих малых молекул затрудняет ограничение их действия на конкретный интересующий регион 15 . Генетические подходы ( например, трансгенезис, система Cre-Lox или мутагенез) часто приводят к необратимой активации или подавлению экспрессии гена-мишени или активности белка 16 , 17 , 18 . Система 19 Tet-On / Tet-Off предлагает улучшенный временный контроль транскрипции генов, но не имеет строгого пространственного контроля, поскольку она основана на диффузии тетрациклина. Недавние разработки в области химически индуцированной димеризации белка 20 или фотосъемки 21 , 22 , 23 , 24 значительно усиливаютВременного управления сигнальными сетями. Однако пространственный контроль остается сложным из-за диффузионного характера химикатов в клетке.

Недавние новые оптикогенные подходы, которые используют силу света для контроля белково-белковых взаимодействий, позволяют модулировать сигнальные пути с высокой пространственно-временной точностью, а также обратимостью. Вскоре после его первоначального успеха в борьбе с нейрональным обжигом 25 , 26 , 27 была расширена оптогенетика для контроля других клеточных процессов, таких как транскрипция генов, трансляция, миграция клеток, дифференцировка и апоптоз 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Стратегия, использующая pНедавно была разработана реакционноспособная гетероактивирующая белковая пара Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) и N-концевой домен взаимодействующей с криптохром базовой спиральной спиральной спирали (CIBN) для управления активностью Raf1-киназы в клетках млекопитающих и эмбрионах Xenopus 35 . CRY2 связывается с CIBN при стимуляции синим светом, а белковый комплекс CRY2 / CIBN спонтанно диссоциирует в темноте 34 . Синий свет возбуждает кофактор CRY2, флавин адениндинуклеотид (FAD), что приводит к конформационному изменению CRY2 и его последующему связыванию с CIBN. Устойчивые активные (W374A) и флавин-дефицитные (D387A) мутанты CRY2 могут быть получены посредством мутаций в FAD-связывающем кармане: мутант CRY2 W374A связывается с CIBN независимо от света, тогда как CRY2 D387A- мутант не связывается с CIBN под синим Стимуляция света 36 , 37 . Оптогенетическая система, описанная iВ этом протоколе используются CRY2 дикого типа и CIBN для индуцирования транслокации, опосредованной транслокацией активации Raf1 в живых клетках. Известно, что мембранный набор Raf1 усиливает его активность 38 . В этой системе тандемный модуль CIBN привязан к плазматической мембране, а CRY2-mCherry слит с N-концом Raf1 35 . В отсутствие синего света CRY2-mCherry-Raf1 остается в цитоплазме, а Raf1 неактивен. Синяя стимуляция индуцирует связывание CRY2-CIBN и рекрутирует Raf1 в плазматическую мембрану, где активируется Raf1. Активация Raf стимулирует каскад сигнализации Raf / MEK / ERK. Оба белка CRY2- и CIBN-гибрида кодируются в бицистронной генетической системе. Эта стратегия может быть обобщена для контроля других киназ, таких как Akt, состояние активации которых также может быть включено путем транслокации белка в клетках 39 . В этой работе представлены подробные протоколы для реализации этой оптигенетической стратегии в культуре клеток млекопитающихRes и многоклеточных организмов.

Protocol

Исследования животных проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Институтом по уходу и использованию животных в Иллинойсе (IACUC) и Департаментом животноводства Университета штата Иллинойс (DAR). 1. Оптогенетическая индукция локализации белка в к?…

Representative Results

Ратиометрическая экспрессия фотоактивируемых белковых пар: на фиг. 1А показана конструкция бицистронной оптикогенной конструкции CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (называемая CRY2-2A-2CIBN) на основе свиного тешовирума- 1 2A (P2A), который показывает самую высокую эффект?…

Discussion

При построении световой коробки необходимо измерить мощность отдельных светодиодов. Основываясь на предыдущем опыте, выходная мощность может варьироваться между отдельными светодиодами из-за разницы в производстве. Выберите набор светодиодов, которые имеют выходную мощность в пред…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Университетом штата Иллинойс в Урбане-Шампейн (UIUC) и Национальными институтами здравоохранения (NIGMS R01GM111816).

Materials

Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochimica. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Tags

Keywords: Light-mediatedReversible ModulationMitogen-activated Protein Kinase PathwayCell DifferentiationXenopus Embryonic DevelopmentOptogenetic InductionCIBN-CRY2 InteractionFluorescence ImagingPHK21 CellsCRY2-mCherry-Raf1 Plasmid
check_url/it/55823?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image