Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em> Xenopus</em> Embriyonik Gelişim
Summary
Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.
Abstract
Kinaz aktivitesi, hücre proliferasyonu, farklılaşma, göç ve apoptoz dahil olmak üzere bir dizi hücresel işlev için çok önemlidir. Erken embriyonik gelişim sırasında, kinaz aktivitesi son derece dinamik ve embriyo boyunca yaygındır. Farmakolojik ve genetik yaklaşımlar, kinaz aktivitelerini saptamak için sıklıkla kullanılır. Ne yazık ki, bu stratejileri kullanarak üstün uzaysal ve zamansal çözünürlüğü elde etmek zor. Dahası, canlı hücreler ve çok hücreli organizmalarda kinaz aktivitesini tersine çevrilebilir bir tarzda kontrol etmek uygun değildir. Böyle bir sınırlama, gelişme ve farklılaşma sırasında kinaz aktivitesinin niceliksel bir şekilde anlaşılabilmesi için bir tıkanıklık olarak kalmaktadır. Bu çalışma, Fotactevatable protein Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) ve kriptokrom etkileşimli bazik-helis-loop-helezon (CIBN) 'nin N-terminal alanını içeren bir bisistronik sistemden yararlanan bir optogenetik strateji sunmaktadır. ReversiAktif protein kinaz (MAPK) sinyal yolağının etkinliği, canlı hücrelerdeki ışık aracılı protein translokasyonu yoluyla sağlanır. Bu yaklaşım, memeli hücre kültürlerine ve canlı omurgalı embriyolarına uygulanabilir. Bu bisistronik sistem benzer aktivasyon mekanizmaları ile diğer kinazların aktivitesini kontrol etmek üzere genelleştirilebilir ve diğer model sistemlerine uygulanabilir.
Introduction
Büyüme faktörleri, çoğalma, farklılaşma, göç ve apoptoz gibi geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesinde yer alır ve embriyonik gelişme, yaşlanma ve mental durumun düzenlenmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik olayda önemli roller oynamaktadır 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Birçok büyüme faktörü, karmaşık hücreiçi sinyalleme kaskadları aracılığıyla sinyal verir. Bu sinyal olayları sıklıkla, tersine çevrilebilir protein fosforilasyonu ile tam olarak düzenlenmiş bir şekilde çalıştırılır ( 6 , 7) . Bu nedenle, protein fosforilasyonundan sorumlu olan protein kinazların sinyal verme sonuçlarının anlaşılması temel olarak önemlidir.
Farklı büyüme faktörleri, oldukça yaygın bir hücre içi sinyal ağı vasıtasıyla etkinken distInt hücresel tepkiler 8 , 9 . Reseptör tirozin kinazların yaygın intraselüler mediatörler arasında Ras, Raf, hücre dışı sinyalle düzenlenmiş kinaz (ERK), mitojen ile aktive olan protein kinaz (MAPK) / ERK kinaz (MEK), fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), Akt ve fosfolipaz C gama (PLCγ) 10 , 11 . Biriken kanıtlar, sinyal çeşitliliği ve özgünlüğün, sinyal faaliyetinin mekânsal ve zamansal düzenlenişine bağlı olduğunu gösterir 12 . Örneğin, fare feokromasitoma hücrelerinde (PC12), hücre proliferasyonuyla sonuçlanan epidermal büyüme faktörü (EGF) uyarımı, geçici olarak ERK yolunu 9 harekete geçirir. Öte yandan, hücre farklılaşmasına yol açan sinir büyüme faktörü (NGF) ile uyarılması, sürekli bir şekilde ERK yolunu aktive eder 9,13. Kültürlü rHipokampal nöronlarda, beyin türevi nörotrofik faktör (BDNF) ile geçici sinyalizasyon primer nevrit büyümesini arttırırken, sürekli sinyalizasyon da artmış nevrit dallanmasına yol açar 14 . Erken embriyonik gelişim sırasında fosforile ERK aktivitesi geçici olarak dinamiktir ve embriyo 6 boyunca yaygındır. Erken Xenopus embriyogenezisindeki yeni bir genetik ekran, iki alt başlıca büyüme faktörü yolağı olan ERK ve Akt sinyalleme kaskadlarının, aşamaya özgü aktivasyon profilleri 7'yi gösterdiğini ortaya koymuştur. Dolayısıyla, kinaz sinyalleme sonuçlarının anlaşılması, yeterli özünürlükle kinaz aktivitesinin mekansal ve zamansal özelliklerini inceleyebilen araçlar için çağrıda bulunur.
Gelişim sırasında sinyal iletiminin dinamik doğasını araştırmaya yönelik geleneksel deneysel yaklaşımlar arzu edilen uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip değildir. Örneğin, farmakolojik yaklaşımlar küçük kimyasal kullanırHücrelerdeki ve dokulardaki sinyal transdüksiyonunu uyarmak veya bastırmak için biyolojik veya moleküler moleküller. Bu küçük moleküllerin dağınık doğası, eylemlerini belirli bir ilgi alanı 15 ile sınırlandırmayı zorlaştırıyor. Genetik yaklaşımlar ( örn., Transgenez, Cre-Lox sistemi veya mutagenez) hedef gen ekspresyonunun veya protein aktivitesinin 16 , 17 , 18'in geri döndürülemez aktivasyonu veya baskılamasına neden olur. Tet-On / Tet-Off sistemi 19 , gen transkripsiyonunun zamana göre daha iyi kontrolünü sağlar, ancak tetrasiklinin difüzyonuna dayandığı için sıkı uzamsal kontrollerden yoksundur. Kimyasal olarak indüklenen protein dimerizasyonu 20 veya foto-kovaj 21 , 22 , 23 , 24'teki son gelişmeler ,Sinyalizasyon ağlarının zamansal kontrolü. Bununla birlikte, mekansal kontrol, kafesli kimyasalların dağılışı nedeniyle zorlayıcı olmaya devam etmektedir.
Protein-protein etkileşimlerini kontrol etmek için ışığın gücünden yararlanan son ortaya çıkan optogenetik yaklaşımlar, yüksek zaman-zamanlı hassaslığın yanısıra reversibilite ile sinyal yollarının modülasyonuna izin verir. Nöronal ateşlemeyi kontrol etme konusundaki ilk başarısının kısa bir süre sonra 25 , 26 , 27 , optogenetics gen transkripsiyonu, translasyon, hücre göçü, farklılaşma ve apoptoz gibi diğer hücresel işlemleri kontrol etmek için genişletildi. 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . P kullanan bir stratejiHitoaktivatüre protein çifti Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) proteini ve kriptokrom etkileşen bazik-helezon-döngüsel helezon (CIBN) 'nin N-terminal bölgesi, yakın zamanda memeli hücrelerinde ve Xenopus embriyolarında Raf1 kinaz aktivitesini kontrol etmek için geliştirildi. CRY2, mavi ışık uyarıldığında CIBN'ye bağlanır ve CRY2 / CIBN protein kompleksi, karanlıkta kendiliğinden ayrılır 34 . Mavi ışık, CRY2 kofaktörü, flavin adenin dinükleotidi (FAD) uyandırır ve CRY2'de konformasyonel değişikliğe ve ardından CIBN'ye bağlanmasına yol açar. CRY2'nin yapısal olarak aktif (W374A) ve flavin eksikliği olan (D387A) mutantları, FAD bağlayıcı cebindeki mutasyonlar yoluyla üretilebilir: CRY2 W374A mutantı ışıktan bağımsız olarak CIBN'ye bağlanırken CRY2 D387A mutantı, mavi altında CIBN'ye bağlanmaz Işık uyarımı 36 , 37 . I tanımlanan optogenetik sistemBu protokol canlı hücrelerde protein translokasyon aracılı Rafl aktivasyonunu başlatmak için vahşi tip CRY2 ve CIBN kullanır. Rafl'in zar alımının etkinliğini arttırdığı bilinmektedir 38 . Bu sistemde, tandem bir CIBN modülü plazma zarına bağlanır ve CRY2-mCherry, Rafl 35'in N-terminaline kaynaştırılır. Mavi ışığın yokluğunda, CRY2-mCherry-Raf1, sitoplazmada kalır ve Raf1 inaktiftir. Mavi ışık uyarımı, CRY2-CIBN bağlanmaya neden olur ve Raf1'in aktive edildiği plazma membranına Rafl'i işe alır. Raf aktivasyonu, bir Raf / MEK / ERK sinyalleme kaskadını uyarır. Hem CRY2 hem de CIBN füzyon proteinleri, bir bisistronik genetik sistemde kodlanır. Bu strateji, aktivasyon durumu aynı zamanda hücrelerdeki protein translokasyonu ile de etkinleştirilebilen Akt gibi diğer kinazları kontrol etmek üzere genelleştirilebilir 39 . Bu çalışma memeli hücre kültüründe bu optogenetik stratejinin uygulanması için ayrıntılı protokoller sunmaktadırRes ve çok hücreli organizmalar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Işık kutusunu oluştururken, tek tek LED'lerin gücü ölçülmelidir. Daha önceki tecrübelere dayanarak, güç çıkışı, üretim varyansına bağlı olarak tek tek LED'ler arasında değişiklik gösterebilir. Birbirinden% 10'luk bir güç çıkışı olan bir dizi LED seçin. LED'lerin sayısı, akım sınırlayıcı direnç ve güç girişi, farklı hücre kültürü kapları tipleri ( örn., 6 kuyucuklu veya 24 kuyulu bir plaka) için değiştirilebilir. 0,2 mW / cm2'lik bir güce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi (UIUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIGMS R01GM111816) tarafından desteklendi.
Materials
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
Riferimenti
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
- Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
- Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
- Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
- Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
- Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
- Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
- Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
- Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
- Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
- Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
- Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
- Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
- Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
- Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
- Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
- Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
- Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
- Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochimica. 50 (1), 4-16 (2011).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
- Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
- Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
- Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
- Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
- Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
- Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
- Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
