Screening analyser betegner romanen Endothelial regulatorer involvert i inflammatorisk respons
Summary
Vaskulære endotelet styrer tett leukocytter rekruttering. Utilstrekkelig leukocytter bloduttredelse bidrar til menneskelig inflammatoriske sykdommer. Derfor er romanen regulatoriske elementer av endothelial aktivering nødvendig for å utforme bedre behandling for inflammatoriske lidelser. Her beskriver vi en omfattende metodikk for å karakterisere romanen endothelial regulatorer som kan endre leukocytter handel ved betennelser.
Abstract
Endothelial laget er avgjørende for å opprettholde homeostase i kroppen ved å styre mange forskjellige funksjoner. Regulering av inflammatorisk respons av endothelial lag er viktig å effektivt bekjempe skadelige innganger og bistand i utvinningen av skadede områder. Når endotelceller er utsatt for en inflammatorisk miljø, for eksempel den ytre delen av gram-negative bakterier membran, lipopolysakkarid (LPS), de express løselig pro-inflammatoriske cytokiner, som Ccl5, Cxcl1 og Cxcl10, og utløse de aktivering av sirkulerende leukocytter. I tillegg aktiverer uttrykk for vedheft molekyler E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1 på endothelial overflaten samhandling og vedheft av de aktiverte leukocytter endothelial laget, og til slutt bloduttredelse mot betent vev. I dette scenariet må endothelial funksjonen være regulert tett fordi overdreven eller defekt aktivering i leukocytter rekruttering kan føre til provoserende-relaterte lidelser. Siden mange av disse lidelser har en effektiv behandling, må romanen strategier med fokus på vaskulær laget undersøkes. Vi foreslår omfattende analyser som er nyttige for søk av romanen endothelial regulatorer som endrer leukocytter. Vi analysere endothelial aktivisering med bestemte uttrykk mål involvert i leukocytter rekruttering (som, cytokiner, chemokines og vedheft molekyler) med flere teknikker, inkludert: sanntid kvantitative polymerase kjedereaksjon ( RT-qPCR), western blot, flow cytometri og vedheft analyser. Disse bestemmer endothelial funksjon i inflammatorisk sammenheng og er svært nyttig å utføre screening analyser betegner romanen endothelial inflammatorisk regulatorer som er potensielt verdifulle utforme nye strategier.
Introduction
Betennelse er en gunstig biologisk reaksjon mot smittsomme sykdommer, med store mål å eliminere patogene og reparere skadet vev. Under visse betingelser, for eksempel kroniske infeksjoner eller autoimmune sykdommer, løses betennelse ikke. I stedet, det er en avvikende reaksjon med kontinuerlig infiltrasjon av leukocytter, noe som resulterer i en langvarig immunrespons som fører til vevsskade, fibrose, tap av funksjon, og samlet, funksjonshemming og i noen tilfeller død pasienten. Disse menneskelige lidelsene, katalogisert som inflammatory lidelser, innebærer alle blodkar for kontroll av leukocytter bloduttredelse1,2.
Endotelceller spiller en grunnleggende rolle i regulering av inflammatorisk respons ved å kontrollere leukocytter menneskehandel. Når endothelial laget er utsatt for inflammatoriske mediatorer som LPS, hvile endotelet aktiverer og uttrykker pro-inflammatoriske cytokiner (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) og vedheft molekyler (E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1) som tjeneste rekruttering av sirkulerende leukocytter til området infeksjon. De leukocytter primet med utgitt cytokiner deretter megle rullende og samhandling med endotelial laget gjennom korrespondent selvklebende motstykkene: PSGL-1 selectin, α4β1 integrin VCAM-1 og αLβ2 integrin ICAM-1. Til slutt, leukocytter migrere over blodkar mot fokus for betennelse3.
Den viktige rollen endotelet i å regulere betennelsesreaksjon har blitt demonstrert på mus som var genetisk endret for å uttrykke den LPS reseptor, toll-like reseptor 4 (TLR4), bare på endotelceller. Disse endothelial-TLR4 dyrene kunne svare på en LPS-mediert betennelse og oppdage infeksjonen generert etter bakterier inoculation, og dermed oppnå infeksjon oppløsning og overlevelse på samme nivå som vill type mus4 , 5.
For endotelet regulert betennelsesreaksjon veien, har det blitt postulert at hemming på noen stadier av leukocytter-endotelet interaksjon ville føre til reduksjon av trans-endothelial migrasjon og en bedre prognosen for provoserende-relaterte sykdommer. Faktisk, er flere strategier målretting endothelial aktivisering og leukocytt-endotelet samspillet utformet for å hindre bloduttredelse av immunceller som behandling for inflammatoriske lidelser6,7.
I denne rapporten beskriver vi en grundig gruppe i vitro teknikker for fullt karakterisere endothelial aktiviteten svar inflammatorisk stimulans LPS og dens rolle leukocytter aktivisering og vedheft på vaskulær laget. Endothelial celle modellen brukes i dette manuskriptet var musen lunge endothelial celle linjen (MLEC-04), som beskrevet av Hortelano et al. 8. den MLEC-04 celle linje har blitt validert i litteraturen til en passende systemet å studere endothelial aktivisering9,10. Basert på forskningsinteresser, disse kan lett ekstrapolert alle endothelial eller leukocytter systemer og provoserende profil. Når endothelial parameterne i de valgte betingelsene er definert, kan systemet teste romanen narkotika på foreslåtte eksperimentering evaluere vaskulær aktiveringen. I denne provoserende sammenheng endotelet cellene testet med sammensatte interesse kan sammenlignes kontrollere forholdene cellene og eventuelle resulterende forskjeller kan informere stoffets prognostiske utfall på utvikling og progresjon av betennelse. For å konkludere, foreslår vi en relevant system for å karakterisere nye stoffet mål til endotelceller, som kan påvirke utformingen av romanen vaskulær-spesifikk terapi mot provoserende-relaterte sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne endothelial protokollen beskriver en gradvis teknologi som etablerer grunnlaget for å utforske romanen mekanismer involvert i regulering av inflammatorisk respons. Disse metodene er basert på studier av endothelial aktiviteten stimulert av LPS og evaluere kritiske trinnene involvert i leukocytter rekruttering under inflammatorisk respons, spesielt: endothelial cytokiner utgivelse, endothelial vedheft molekyler uttrykk og leukocytter vedheft på vaskulær laget. Når endothelial parameterne er etablert, systemet k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) og i Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (bevilgning nummer IERPY 1149/16 til Al; MPY 1410/09 til S. Hortelano); av MINECO gjennom Fondo de Investigación no Salud (FIS) (gir tall PI11.0036 og PI14.0055 S. Hortelano). S. Herranz ble støttet av IERPY 1149/16 fra ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
Riferimenti
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
