Screening analyser för att karakterisera roman Endothelial tillsynsmyndigheter deltar i den inflammatoriska reaktionen
Summary
Vaskulära endotel styr tätt leukocyt rekrytering. Otillräcklig leukocyt extravasering bidrar till inflammatoriska sjukdomar. Söka efter romanen reglerande element av endothelial aktivering därför nödvändigt att utforma förbättrade terapier för inflammatoriska sjukdomar. Här beskriver vi en omfattande metod för att karakterisera roman endothelial regulatorer som kan ändra leukocyt människohandel vid inflammation.
Abstract
Den endothelial lagret är väsentliga för att upprätthålla homeostas i kroppen genom att kontrollera många olika funktioner. Regleringen av den inflammatoriska reaktionen av endothelial lagret är avgörande för att effektivt bekämpa skadliga ingångar och stöd i återhämtning av skadade områden. När endotelceller utsätts för en inflammatorisk miljö, såsom den yttersta delen av gramnegativa bakterier membran, lipopolysackarid (LPS), de express lösliga pro-inflammatoriska cytokiner, såsom Ccl5, Cxcl1 och Cxcl10, och utlösa de aktivering av cirkulerande leukocyter. Dessutom möjliggör uttrycket av adhesionsmolekyler E-selektin, VCAM-1 och ICAM-1 på endotelceller ytan interaktion och vidhäftning av de aktiverade leukocyter till endothelial lagret, och så småningom extravaseringen mot inflammerad vävnad. I det här fallet måste endotelfunktion regleras tätt eftersom överdriven eller defekta aktivering i leukocyt rekrytering kan leda till inflammatoriska-relaterade sjukdomar. Eftersom många av dessa sjukdomar inte har en effektiv behandling, måste nya strategier med fokus på vaskulär lager undersökas. Vi föreslår omfattande analyser som är användbara för sökning av romanen endothelial regulatorer som ändra leukocyt funktion. Vi analyserar endothelial aktivering med hjälp av specifika uttryck mål inblandning i leukocyt rekrytering (såsom, cytokiner, chemokiner och adhesionsmolekyler) med flera tekniker, inklusive: realtid kvantitativa polymerasen kedjar reaktion ( RT-qPCR), western-blot, flow flödescytometri och vidhäftning analyser. Dessa metoder bestämma endotelfunktion i samband med inflammatorisk och är mycket användbara för att utföra screening analyser för att karakterisera roman endothelial inflammatoriska regulatorer som är potentiellt värdefulla för att utforma nya terapeutiska strategier.
Introduction
Inflammation är ett fördelaktigt biologiska svar mot smittämnen, med stora målet att eliminera patogenen och reparera skadad vävnad. Under vissa förhållanden, till exempel kroniska infektioner eller autoimmuna sjukdomar, löser inte inflammation. I stället finns det en avvikande reaktion med kontinuerlig infiltration av leukocyter, vilket resulterar i en långvarig immunsvar som leder till vävnadsskada, fibros, förlust av funktion, och övergripande, funktionshinder och i vissa fall döden av patienten. Dessa mänskliga sjukdomar, katalogiseras inflammatoriska sjukdomar som, alla innebär att blodkärlen för kontroll av leukocyter extravasering1,2.
Endotelceller spela en grundläggande roll i regleringen av den inflammatoriska reaktionen genom att kontrollera leukocyt människohandel. När endothelial lagret utsätts för inflammatoriska mediatorer såsom LPS, vilande endotelet aktiverar och uttrycker pro-inflammatoriska cytokiner (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) och adhesionsmolekyler (E-selektin, VCAM-1 och ICAM-1) som tjänst rekrytering av cirkulerande leukocyter till webbplatsen infektion. Cellväggar Primas av den släppta cytokiner sedan medla rullande och interaktion med endothelial lagret genom de korrespondent självhäftande motsvarigheterna: PSGL-1 till selektin, α4β1-integrin till VCAM-1 och αLβ2 integrin till ICAM-1. Slutligen, cellväggar migrerar över vaskulatur mot fokus för inflammation3.
Den viktiga rollen som endotelet i regleringen av den inflammatoriska reaktionen har visats på möss som var genetiskt modifierad för att uttrycka den LPS-receptorn, toll-like receptor 4 (TLR4), endast på endotelceller. Dessa endothelial-TLR4 djur kunde svara en LPS-medierad inflammation och upptäcka infektionen genereras efter bakterier Inympning, och följaktligen uppnå infektion upplösning och överlevnad på liknande nivåer som vilda typ möss4 , 5.
För den endotel-reglerade inflammatorisk reaktion vägen, har det varit postulerade att hämning i vissa skeden av leukocyt-endotel interaktionen skulle resultera i en minskning av trans-endothelial migration och en bättre prognos för inflammatoriska sjukdomar. I själva verket har flera strategier inriktning endothelial aktivering och leukocyt-endotel interaktionen utformats för att hindra extravasering av immunceller som en behandling av inflammatoriska sjukdomar6,7.
I den här rapporten beskriver vi en grundlig grupp av in vitro- metoder för att fullständigt karakterisera aktiviteten endothelial svar på inflammatoriska stimulans LPS och dess roll i leukocyt aktivering och vidhäftning till vaskulär lager. Endotelcell modellen används i detta manuskript var raden mus lung endotelceller (MLEC-04), som beskrivs av Hortelano et al. 8. the MLEC-04 cellinje har validerats i litteraturen vara ett lämpligt system att studera endothelial aktiveringen9,10. Baserat på forskningsintressen, dessa synsätt kan lätt extrapoleras till alla endotelceller eller leukocyt system och inflammatoriska profil. När endothelial parametrarna i de markerade villkoren definieras, kan systemet testa nya läkemedel på den föreslagna experiment att utvärdera vaskulär aktiveringen. I sammanhanget inflammatoriska endotel cellerna testade med sammansatta av intresse kan jämföras med villkoren kontroll av celler, och alla resulterande skillnader kan informera drogens prognostiska resultatet på utveckling och progression av inflammation. Sammanfattningsvis föreslår vi ett relevanta system för att karakterisera nya läkemedelsmål till endotelceller, vilket kan påverka utformningen av romanen vaskulär-specifika behandlingar mot inflammatoriska sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta endothelial protokollet beskriver en stegvis teknik som skapar grunden för att utforska nya mekanismer som är involverade i regleringen av den inflammatoriska reaktionen. Dessa metoder är baserade på studien av aktiviteten endotelceller stimuleras av LPS och utvärdera de kritiska steg involverade i leukocyt rekrytering under den inflammatoriska reaktionen, specifikt: endothelial cytokiner release, endothelial vidhäftning molekyler uttryck och leukocyt vidhäftning till vaskulär lager. När parametrarna endot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) och Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (licensnummer IERPY 1149/16 att A.L.; MPY 1410/09 till S. Hortelano); av MINECO genom de Fondo de Investigación en Salud (FIS) (bidrag nummer PI11.0036 och PI14.0055 till S. Hortelano). S. Herranz stöddes av IERPY 1149/16 från ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
Riferimenti
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
