Screening tests karakteriseren roman Endothelial toezichthouders die betrokken zijn bij de ontstekingsreactie
Summary
Vasculaire endotheel bepaalt strak leukocyte werving. Onvoldoende leukocyte extravasation draagt bij tot de inflammatoire ziekten bij de mens. Daarom is zoeken naar nieuwe regelgevende elementen van endothelial activering om te ontwerpen van verbeterde therapieën voor inflammatoire aandoeningen. Hier beschrijven we een uitgebreide methodologie om te karakteriseren roman endothelial regelgevers die leukocyte handel tijdens ontsteking kunnen wijzigen.
Abstract
De endothelial laag is essentieel voor het behoud van de homeostase in het lichaam door het beheersen van veel verschillende functies. Regulering van de ontstekingsreactie door de endothelial laag is cruciaal voor het efficiënt bestrijden van schadelijke ingangen en hulp bij het herstel van beschadigde gebieden. Wanneer de endotheliale cellen worden blootgesteld aan een inflammatoire omgeving, zoals de buitenste component van gram-negatieve bacteriën membraan, lipopolysaccharide (LPS), ze uiten van oplosbare pro-inflammatoire cytokines, zoals Ccl5, Cxcl1 en Cxcl10, en leiden tot de activering van de circulerende leukocyten. Bovendien is de uitdrukking van celadhesie-moleculen E-selectine, VCAM-1 en ICAM-1 op het endotheel oppervlak kan de interactie en de hechting van de geactiveerde leukocyten aan het endotheel laag en uiteindelijk de extravasation naar het ontstoken weefsel. In dit scenario moet de endothelial functie strak geregeld omdat buitensporige of defecte activering in de aanwerving van leukocyten tot inflammatoire-gerelateerde aandoeningen leiden kan. Aangezien veel van deze aandoeningen niet over een effectieve behandeling beschikt, moeten nieuwe strategieën met een focus op de vasculaire laag worden onderzocht. Wij stellen voor uitgebreide tests die nuttig zijn voor het zoeken van nieuwe endothelial regelgevers die leukocyte functie wijzigen. We endotheel activering analyseren met behulp van de doelen van de specifieke expressie die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten (bijvoorbeeld cytokines, chemokines en celadhesie-moleculen) met verschillende technieken, waaronder: real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie () RT-qPCR), de western-blot, stroom cytometry en hechting testen. Deze benaderingen endothelial functie in de inflammatoire context bepalen en zijn zeer nuttig voor het uitvoeren van screening tests karakteriseren roman endothelial inflammatoire regelgevers die potentieel waardevolle voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën.
Introduction
Ontsteking is een gunstig biologische reactie tegen infectieuze agentia, met het grote doel te elimineren van het pathogene agens en het herstellen van beschadigd weefsel. Onder bepaalde voorwaarden, zoals chronische infecties of auto-immune ziekten, ontsteking niet is opgelost. In plaats daarvan is er een afwijkende reactie met continue infiltratie van leukocyten, resulterend in een langdurige immuunrespons die leidt tot weefselbeschadiging, fibrose, verlies van functie, en de algehele, handicap en in sommige gevallen dood van de patiënt. Deze menselijke aandoeningen, gecatalogiseerd als ontstekingsziekten, alle betrekking hebben op de bloedvaten voor de controle van leukocyten extravasation1,2.
De endotheliale cellen spelen een fundamentele rol in de regulatie van de ontstekingsreactie door het beheersen van de leukocyten mensenhandel. Wanneer het endotheel laag is blootgesteld aan inflammatoire mediatoren zoals LPS, de rust endotheel activeert en spreekt van pro-inflammatoire cytokines (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, enz.) en celadhesie-moleculen (E-selectine, VCAM-1 en ICAM-1) die gunst werving van circulerende leukocyten op de site van de infectie. De leukocyten primer door de vrijgegeven cytokines dan bemiddelen rollen en interactie met de endothelial laag door de correspondent zelfklevende tegenhangers: PSGL-1 selectine, α4β1 integrine aan VCAM-1 en αLβ2 integrine aan ICAM-1. Tot slot migreren de leukocyten over de therapieën richting de focus ontsteking3.
De essentiële rol van het endotheel bij het reguleren van de inflammatoire respons is aangetoond op muizen die werden genetisch gewijzigd om uit te drukken de LPS receptor, toll-like receptor 4 (TLR4), alleen op de endotheliale cellen. Deze endotheel-TLR4 dieren konden reageren op een ontsteking LPS-gemedieerde en detecteren de infectie gegenereerd na inoculatie van de bacteriën, en bijgevolg bereiken infectie resolutie en overleven op een vergelijkbaar niveau als de muizen wild type4 , 5.
Voor het endotheel-gereglementeerde ontstekingsreactie traject, heeft het is gepostuleerd dat de remming in bepaalde stadia van de leukocyten-endotheel interactie zou resulteren in de vermindering van de trans-endothelial migratie en een betere prognose voor inflammatoire-gerelateerde ziekten. In feite, zijn verschillende strategieën gericht op de endotheliale activering en leukocyten-endotheel interactie te hinderen extravasation van immune cellen als een behandeling voor inflammatoire aandoeningen6,7ontworpen.
In dit verslag beschrijven we een grondige groep van in vitro technieken om de endothelial activiteit in reactie op de inflammatoire stimulans LPS en haar rol bij activering van de leukocyten en hechting aan de vasculaire laag volledig te karakteriseren. De endothelial cell model gebruikt in dit manuscript was de muis Long endothelial cellijn (MLEC-04), zoals beschreven door Hortelano et al. 8. de MLEC-04 cellijn is gevalideerd in de literatuur als een passend systeem om te studeren endothelial activering9,10. Op basis van het onderzoeksinteresses, deze benaderingen kunnen worden gemakkelijk geëxtrapoleerd naar ieder endothelial of leukocyten systemen en inflammatoire profiel. Zodra de endothelial parameters in de geselecteerde voorwaarden zijn gedefinieerd, kan het systeem nieuwe medicijnen op de voorgestelde experimenten te evalueren van de vasculaire activering testen. In deze inflammatoire context, de cellen van de endotheel getest met de stof van belang kunnen worden vergeleken met de controlevoorwaarden van de cellen en eventuele resulterende verschillen kunnen in kennis stellen van de drug prognostische resultaat op de ontwikkeling en de vooruitgang van ontsteking. Tot slot stellen wij voor een relevante systeem karakteriseren nieuwe drug targets op de endotheliale cellen, die invloed op het ontwerp van nieuwe vasculaire-specifieke therapieën tegen inflammatoire-gerelateerde ziekten uitoefenen kunnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit endotheel protocol beschrijft een stapsgewijze technologie die de basis leggen voor verkennen nieuwe mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van de ontstekingsreactie vaststelt. Deze benaderingen zijn gebaseerd op de studie van het endotheel activiteit gestimuleerd door LPS en evalueren van de kritische stappen betrokken bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten tijdens de ontstekingsreactie, specifiek: endothelial cytokines release, endotheel hechting moleculen expressie en leukocyten hechting aan de v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) en het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (subsidie getal IERPY 1149/16 A.L.; MPY 1410/09 naar S. Hortelano); door de MINECO via het Fondo de Investigación en Salud (FIS) (S. Hortelano verleent nummers PI11.0036 en PI14.0055). S. Herranz werd gesteund door IERPY 1149/16 van ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
Riferimenti
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
